《The FASEB Journal》：Imperatorin Mitigates Rosacea-Like Inflammation by Modulating the Crosstalk Between JNK1 and STAT1
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这项研究首次揭示了欧前胡素（Imperatorin, IMP）——一种天然呋喃香豆素化合物，在调控酒渣鼻（rosacea）样皮肤炎症中的治疗潜力。通过生物信息学、网络药理学及体内外实验，研究阐明了IMP的核心作用机制：它能够直接结合JNK1（c-Jun N-terminal kinase 1）和STAT1（signal transducer and activator of transcription 1），破坏二者间的相互作用，从而抑制STAT1的磷酸化、核转位及其下游炎症因子（如IL-6、TNF-α、VEGF等）的表达。这项研究为开发靶向JNK1/STAT1信号互作的新型抗酒渣鼻药物提供了重要的理论依据和候选分子。
3.1 IMP调控多种与炎症相关的信号通路
本研究首先利用生物信息学与网络药理学方法探索了欧前胡素（Imperatorin, IMP）的潜在作用靶点与通路。通过整合Swiss Target Prediction和SuperPred数据库，鉴定出174个IMP潜在作用蛋白。对这些靶点进行功能富集分析（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析发现，IMP的靶点显著富集于信号转导、炎症反应、蛋白磷酸化、血管生成等生物过程。分子功能分析显示，这些靶点主要涉及蛋白结合、蛋白激酶活性等。关键的KEGG通路分析结果表明，IMP相关靶点富集于JAK-STAT、MAPK、VEGF、cAMP、AMPK及PI3K-AKT等信号通路，这些通路在炎症及酒渣鼻发病中扮演着重要角色。
3.2 JNK1和STAT1被鉴定为IMP的直接作用靶点
为了进一步明确IMP治疗酒渣鼻的具体分子靶点，研究者结合了酒渣鼻患者与正常人的基因表达谱数据（GEO数据集GSE65914），筛选出1227个在酒渣鼻中上调的差异表达基因，并从GeneCards等数据库获取了1425个酒渣鼻相关基因。通过韦恩图分析，确定了15个IMP靶点与酒渣鼻相关基因的交集基因。随后，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape Hubba插件筛选核心靶点。结果显示，MAPK8（即JNK1）、STAT1、CXCR4、CCR2、FLT1、NOS2、PTAFR和FPR1是IMP治疗酒渣鼻的核心靶点。结合KEGG分析结果，研究者聚焦于JNK1和STAT1这两个关键分子。值得注意的是，JNK1和STAT1在酒渣鼻组织样本中的表达呈显著正相关，暗示二者之间存在潜在的相互作用。
3.3 腹腔注射IMP显著减轻LL37诱导的小鼠酒渣鼻样皮肤炎症
在动物模型层面，研究评估了IMP对LL37肽诱导的小鼠酒渣鼻样表型的疗效。结果显示，与对照组相比，腹腔注射IMP（20 mg/kg）能显著减轻小鼠背部的红斑面积和严重程度评分。组织病理学（H&E）染色分析证实，IMP治疗显著减少了皮肤中的炎性细胞浸润。甲苯胺蓝染色进一步表明，IMP能有效降低酒渣鼻样皮损中肥大细胞的数目。
3.4 局部外用IMP同样可缓解小鼠酒渣鼻样皮肤炎症
为了评估IMP的局部治疗潜力，研究者配制了3%的IMP-凡士林软膏，并外用于LL37诱导的小鼠背部皮肤。结果表明，局部外用IMP同样能显著改善酒渣鼻样症状，表现为红斑评分和皮损面积的减少。组织学检查也再次确认了外用IMP可降低表皮厚度和肥大细胞数量。这些结果共同表明，无论是全身给药还是局部用药，IMP都能有效缓解酒渣鼻样皮肤炎症，具有潜在的治疗价值。
3.5 IMP在LL37刺激的HaCaT细胞中调控STAT1活化并抑制炎症因子水平
在细胞层面，研究者利用人永生化角质形成细胞（HaCaT）进行了深入机制探索。细胞活性实验（CCK-8）表明，低于20 μM的IMP对HaCaT细胞无毒性。在LL37刺激的HaCaT细胞中，IMP处理（10 μM和20 μM）并未显著改变JNK1和STAT1的mRNA水平。然而，蛋白质免疫印迹（Western blot）分析发现，LL37刺激显著诱导了STAT1的磷酸化，而IMP处理能以浓度依赖的方式显著抑制这种磷酸化，但对JNK1的表达及其磷酸化水平无明显影响。进一步的实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测显示，LL37刺激显著上调了多种炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP9、VEGF）的mRNA表达，而IMP处理可有效抑制这些因子的表达。
3.6 IMP降低酒渣鼻样小鼠模型中STAT1的磷酸化并抑制炎症因子水平
体内实验数据与体外结果相互印证。在LL37诱导的小鼠酒渣鼻样皮损组织中，IMP治疗同样能显著降低STAT1的磷酸化水平。免疫组织化学（IHC）分析进一步显示，IMP减少了STAT1在表皮细胞核中的定位。此外，qRT-PCR检测证实，IMP处理降低了皮损组织中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP9和VEGF等关键炎症因子的mRNA水平。这些结果表明，IMP通过调控STAT1的磷酸化及其核转位，进而抑制下游炎症细胞因子的产生。
3.7 分子对接与蛋白质-蛋白质对接结果
为了在结构层面验证IMP与靶点的相互作用，研究者进行了分子对接模拟。结果显示，IMP与JNK1（PDB ID: 8PT8）和STAT1（PDB ID: 1YVL）均能以较低的结合能稳定结合，结合亲和力分别为-7.9 kcal/mol和-7.0 kcal/mol，表明存在较强的相互作用。值得注意的是，IMP在STAT1上的结合位点位于介导蛋白质-蛋白质相互作用的区域，而非负责磷酸化的SH2结构域。随后的蛋白质-蛋白质对接分析预测了JNK1与STAT1之间存在直接结合的可能性，并且有趣的是，IMP在JNK1和STAT1上的结合位点，恰好与JNK1-STAT1相互作用的氨基酸位点重叠。这提示IMP可能通过占据这些结合位点，干扰JNK1与STAT1的相互作用。
3.8 IMP干扰JNK1与STAT1的相互作用，降低STAT1磷酸化
为验证上述预测，研究者进行了功能实验。在HaCaT细胞中敲低JNK1的表达后，STAT1的磷酸化水平显著下降。免疫荧光（IF）结果显示，敲低JNK1减少了LL37诱导的STAT1核转位及核内磷酸化STAT1（p-STAT1）的水平，表明STAT1是JNK1的直接底物。关键的免疫共沉淀（Co-IP）实验证实，在正常条件下JNK1与STAT1存在相互作用，而IMP处理显著减弱了这种相互作用。此外，细胞热转移分析（CETSA）显示，IMP处理增加了JNK1和STAT1蛋白的热稳定性，为IMP在活细胞内与这两个靶点结合提供了直接证据。相应的免疫荧光实验也观察到，IMP处理同样能减少LL37诱导的STAT1核转位和核内p-STAT1水平。
综上所述，本研究揭示了一个新的调控轴：在酒渣鼻样炎症中，JNK1与STAT1相互作用并促进STAT1的磷酸化活化。天然化合物欧前胡素（IMP）能够直接结合JNK1和STAT1，破坏二者间的互作，从而抑制STAT1的磷酸化、核转位及其介导的下游炎症因子表达，最终缓解酒渣鼻样皮肤炎症症状。这项研究不仅首次报告了IMP在酒渣鼻治疗中的潜力，还为靶向JNK1/STAT1信号互作开发新型抗炎药物提供了创新的思路和实验依据。
