分枝杆菌硫糖脂-1是一种新型的宿主肌动蛋白动态调节因子

《Microbiological Research》：Mycobacterial Sulfoglycolipid-1 is a novel regulator of host actin dynamics

宿主细胞膜磷脂酰肌醇与F-actin相互作用受结核分枝杆菌硫脂糖脂SL-1调控，通过改变胆固醇富集膜域分布和磷脂酰肌醇聚集，影响Arp2/3、N-WASP等蛋白与actin网络动态，导致cofilin介导的actin解聚及膜相关actin重组，促进细菌摄取。

　　

Aishi Dasgupta|Manjari Mishra|Shobhna Kapoor

印度理工学院孟买分校化学系，印度孟买400076

摘要

病原体拥有多种策略来利用宿主的分子机制以促进其进入和致病过程。宿主细胞骨架已成为被最广泛利用的宿主组成部分，但其背后的机制却研究较少。在这里，我们利用基于定量显微镜的技术揭示了分枝杆菌中的硫糖脂SL-1如何改变宿主质膜、磷脂酰肌醇脂质和F-actin之间的相互作用。磷脂酰肌醇和F-actin的变化分布进一步影响了它们与关键细胞骨架蛋白（如Arp2/3、N-WASP、cofilin、vinculin和talin）的相互作用，这些蛋白参与肌动蛋白的组装和分解。研究表明，SL-1减少了富含胆固醇的质膜区域，并将磷脂酰肌醇隔离到新的脂质结构中，从而增强了质膜上与肌动蛋白的相互作用；然而，磷脂酰肌醇的这种保护作用减少了其与肌动蛋白结合蛋白的相互作用。最值得注意的是，cofilin与磷脂酰肌醇脂质和F-actin之间的相互作用减弱，同时ADP-核糖化因子（Arf）GTP酶激活蛋白也减少了，这导致肌动蛋白以ASAP-1依赖的方式发生断裂。这种表型促进了细菌在宿主体内的吸收，并通过改变肌动蛋白的排列和丝状伪足的动态来调节细胞迁移。总体而言，我们的发现突出了结核分枝杆菌脂质暴露时宿主细胞骨架重塑过程中涉及的关键分子事件和参与者，从而增强了细菌在宿主体内的吸收。

引言

包括结核分枝杆菌（Mtb）在内的细胞内病原体已经掌握了多种策略来破坏控制基本细胞功能的宿主机制，从而促进其进入、存活、逃避免疫系统并扩散（Alonso和Garcia-del Portillo，2004）。其中，细胞骨架作为高度动态且重要的宿主结构组成部分，被许多细胞内病原体所操纵以推动感染。特别是肌动蛋白的重塑在多种感染中起着关键作用。肌动蛋白细胞骨架的动态由肌动蛋白聚合和分解蛋白的招募所调节。肌动蛋白需要核化因子，如肌动蛋白相关蛋白2/3复合体（Arp2/3），该复合体与Wiskott-Aldrich综合征（WASP）结合以启动核化过程（Goley和Welch，2006；Rotty等人，2013；Machesky等人，1999）。肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚单位2（ARPC2）是该复合体的核心成分。随后，Arp2/3诱导的F-actin分支受到核化促进因子（NPFs）的调节，例如N-WASP、SCAR和WASH（Higgs和Pollard，1999；Linardopoulou等人，2007）。肌动蛋白的分解由细胞质蛋白cofilin介导，这种蛋白在细胞膜上也是不活跃的状态（Tanaka等人，2018；Wioland等人，2017）。vinculin、talin和eazrin是膜相关的肌动蛋白调节焦点粘附蛋白，它们通过提供基底来促进膜-肌动蛋白连接（Franz等人，2023；Boujemaa-Paterski等人，2020；Gautreau等人，1999）。膜与肌动蛋白细胞骨架之间的连接主要由宿主膜脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂）调节（Senju等人，2017；Senju和Lappalainen，2019；Fievet等人，2004；Buhr等人，2023）。PI(4,5)P₂通过平衡参与肌动蛋白聚合、分解以及与膜/细胞粘附复合体连接的蛋白质的高保真物理相互作用，成为肌动蛋白动态的主要调节因子，因此成为病原体可利用的途径（Senju等人，2017；Senju和Lappalainen，2019；Fievet等人，2004；Buhr等人，2023）。

通过操纵肌动蛋白网络，病原体可以促进自身进入宿主细胞，从宿主细胞器中获取营养，并创造有利于其生存的环境。例如，立克次体、衣原体和沙门氏菌等病原体会增强肌动蛋白的聚合，导致F-actin在附着位点局部浓缩，进而引起膜起皱，从而促进其吸收（Gouin等人，2004；Jewett等人，2006；Zhou等人，2001）。其他病原体如单核细胞增生李斯特菌和SFG立克次体会在病原体表面重塑肌动蛋白，形成肌动蛋白尾部/彗星结构，有助于病原体在宿主细胞内的移动或感染邻近细胞（Reed等人，2014；Skoble等人，2000）。宿主细胞表面的肌动蛋白重组会形成膜突起（例如埃立克体chaffeensis），并连接受感染和未受感染的相邻细胞（Rikihisa，2010）。某些病原体，如衣原体或艰难梭菌，在进入宿主体内后会诱导肌动蛋白分解，导致应力纤维减少和宿主细胞死亡，这是一种免疫逃避和扩散的形式（Aktories等人，2017；Lutter等人，2013）。病原体特异性效应子常常通过不同的途径模拟或功能上类似于宿主的肌动蛋白核化或分解因子，这体现了宿主-病原体相互作用的多样性（Colonne等人，2016），但许多情况下其详细的分子机制仍不清楚。

首次关于结核分枝杆菌（Mtb）调节肌动蛋白网络能力的研究发现，肌动蛋白呈现点状或细小纤维，表明发生了肌动蛋白的分解。也有研究观察到肌动蛋白彗星的形成以增强细胞内的运动能力，但这主要针对海分枝杆菌（M. marinum），对于结核分枝杆菌（Mtb）尚无明确共识（Guerin和de Chastellier，2000；Stamm等人，2003），这表明肌动蛋白彗星可能在感染早期发挥作用。值得注意的是，较小的肌动蛋白片段不一定表示分解；它们也可能来源于肌动蛋白聚合形成新的短结构。此外，研究表明，结核分枝杆菌可以激活宿主的F-actin结合蛋白coronin 1a，从而干扰自噬体的形成（Seto等人，2012）。同样，有报道指出，活性WASH被招募到分枝杆菌的液泡中可以增强肌动蛋白的聚合，进而阻止其与酸性区室的融合（Kolonko等人，2014）。有趣的是，WASH与F-actin的结合依赖于感染阶段，表明分枝杆菌液泡上的F-actin核化在感染过程中受到显著调控。下调Arf GTP酶激活蛋白1可以通过诱导肌动蛋白重组来增加分枝杆菌的进入（Song等人，2018）。我们最近还发现，原本在完整分枝杆菌中观察到的细胞质肌动蛋白点状表型也可以由纯化的结核分枝杆菌硫糖脂SL-1再现（Mishra等人，2019；Mishra和Kapoor，2021），这种脂质的表面丰度与感染阶段和毒力相关（Mishra等人，2020）。特别是，这种效应是脂质结构特异性的，因为其他有毒脂质如phthiocerol dimycocerosate（PDIM）和trehalose dimycolate（TDM）并未引起这种表型（Mishra等人，2020）。总体而言，这些发现表明结核分枝杆菌在感染过程中对肌动蛋白进行了特定的重塑，但其背后的分子机制以及涉及的宿主和病原体因素仍不清楚。这成为了本研究的重点，并表明分枝杆菌的SL-1脂质是一种在感染过程中介导肌动蛋白重塑的效应因子。通过广泛的显微镜和细胞生物学方法，我们揭示了SL-1调节宿主细胞骨架以增强细菌吸收的潜在分子机制。本研究描述了复杂的细胞骨架-膜机制以及参与调节感染期间SL-1介导的肌动蛋白重连的关键参与者。

部分摘录

结核分枝杆菌脂质重塑宿主膜细胞骨架网络的移动性和动态

在本研究中，所有脂质的使用浓度都在生理范围内，与细菌外膜中天然脂质的含量（30--31）相当，并且已知这些脂质会被细菌释放（Beatty等人，2000）。我们之前已经表明，不同的结核分枝杆菌脂质会以不同的方式改变宿主质膜的有序性和流动性（Mishra和Kapoor，2021）。因此，改变的膜性质可能会影响脂质和蛋白质的平面扩散

讨论与结论

膜是一种高度动态的结构，其功能性的蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用调节着各种细胞功能。在宿主-病原体相互作用过程中，这些相互作用的扰动可以调节宿主对外来病原体的反应。特别是SL-1已被证明可以在宿主细胞中诱导肌动蛋白点状结构的形成，而PDIM则导致肌动蛋白体积/细胞体积的增加。在这项工作中，我们探讨了膜动态和侧向组织对外来外膜反应的变化

方法和材料

关键资源表

试剂或资源	来源	标识符
抗cofilin
Anti-N WASP (EPR6959)	Abcam	ab133315
Anti-ARPC2 (EPR8533)	Abcam	ab133315
Anti-Ezrin (3C12)	Abcam	ab4069
Anti-PIP2 (2C11)	Abcam	ab11039
Anti-ASAP-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-374410
山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor? 488	Thermo Fisher	目录号 A-11008
山羊抗鼠IgG (H+L)，Superclonal? 重组二级抗体，Alexa Fluor? 561	Thermo Fisher	目录号 A-11004
山羊抗兔IgG

CRediT作者贡献声明

Aishi Dasgupta：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，数据分析，数据管理。Manjari Mishra：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，数据分析，概念化。Shobhna Kapoor：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，项目监督，资金获取，数据分析，概念化。

利益冲突声明

所有作者均声明没有利益冲突。

致谢与资助

本工作得到了DBT/Welcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/21/1/505624) 的支持，该奖学金授予了SK。感谢IIT Bombay提供的中心共聚焦显微镜和质谱设施。作者感谢BEI Resources、NIAID和NIH提供的纯化硫糖脂-1（NR-14845）、phthiocerol Dimycocerosate（NR-20328）和HEK-293 TLR2YFP（NR-9316）。同时感谢MP Biomedical和WRCB联合企业提供的试剂。

利益冲突

作者