Armillaria属真菌的根状内生细菌群落及其对Armillaria gallica和Gastrodia elata生长促进作用的研究

《Microbiological Research》：TRhizomorph endophytic bacterial community of Armillaria and growth promotion of Armillaria gallica and Gastrodia elata

菌索内生细菌促进兰芋生长的机制研究。通过分离培养和高通量测序分析云南兰芋种植区菌索内生细菌群落，发现核心属包括伯克霍尔德氏菌、未分类α-变形菌等，其群落结构受菌种特性和土壤pH、速效磷钾等特性显著影响。筛选出产脲酶、溶磷和溶钾能力的28株细菌，其中2株通过三重共培养使兰芋块茎增产达23.6%-35.8%。研究揭示了内生细菌在真菌-兰芋共生网络中的关键作用。

　　

金晓涵|李宇|李玉璇|王玉川|何海燕|张汉波

中国云南省生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明，650504

摘要

Armillaria是Gastrodia elata块茎后期生长的重要共生真菌。我们通过分离培养和高通量测序方法分析了定植在Armillaria菌根中的细菌群落。研究发现：(1)与G. elata共生的Armillaria菌根中含有多种内生细菌，主要属包括Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（10.32%）、Alphaproteobacteria_unclassified（9.00%）、Bradyrhizobium（7.09%）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（5.12%）和Yersinia（3.20%）。Armillaria种类和土壤特性（pH值、AP值和AK值）等因素显著影响内生细菌的群落结构。(2)从Armillaria菌根中分离出49株细菌，其中优势属为Pseudomonas（28.57%）、Bacillus（22.45%）、Viridibacillus（12.24%）、Rouxiella（10.20%）和Priestia（8.16%）。所有分离出的细菌均能产生IAA，其中3株具有钾水解能力，14株具有磷溶解能力。(3)在细菌与Armillaria gallica YSP2_1的共培养实验中，大多数细菌抑制了A. gallica的漆酶产生和菌根分枝，但能增加A. gallica的生物量。在双重共培养实验中，两种细菌1YSL_5_Viridibacillus和1YSL_7_Peribacillus显著提高了G. elata块茎的产量。研究表明，菌根内生细菌有助于促进Armillaria与G. elata之间的相互作用。

引言

兰科植物是地球上最多样且分布最广的植物家族之一（Merckx, 2012）。由于兰科种子养分含量有限，它们需要依赖各种共生真菌才能发芽和生长，这种营养方式被称为菌异养（Arditti和Ghani, 2000; Batty等, 2001; Rasmussen和Rasmussen, 2009）。Gastrodia elata是一种无叶绿素的完全菌异养兰花，主要分布在东亚、南亚和大洋洲（Liu等, 2015），具有重要的药用和食用价值（Ahn等, 2007）。在种子萌发过程中，G. elata与Mycena真菌共存，随后在生长后期与Armillaria真菌建立共生关系。它们依靠Armillaria分解木材和菌丝，从而获取形成块茎和进行有性繁殖所需的养分，完成36个月的生命周期（Kim等, 2006）。

Armillaria属于担子菌门，是一种兼性腐生真菌，主要分布在许多国家的温带和热带森林中（Keca和Solheim, 2011）。Armillaria的菌丝可分为两部分：外层的白色细长菌丝结构和类似植物根系的根状菌根结构，菌根表皮包裹着红棕色鞘。菌根由外层的保护层、内层的柔软次皮层以及中间的核心部分组成（Przemieniecki等, 2021）。菌根具有多种功能，如分化为子实体、感染宿主植物以及输送养分。

在东亚，Armillaria与Galeola和Gastrodia等非光合兰花形成异养菌根共生关系（Masuhara和Katsuya, 1991; Guo等, 2016）。在Armillaria与G. elata的共生期间，Armillaria通过侵入G. elata的内部组织形成“桥梁”，促进养分传输。在中国，多种Armillaria种类可以与G. elata共存，但并非所有Armillaria菌株都能形成共生关系（Guo等, 2016）。此外，经过多代繁殖后，Armillaria的功能可能会退化，导致其向G. elata提供养分的能力减弱（Yu等, 2022）。此外，商业Armillaria菌株与当地G. elata菌株之间的兼容性不稳定也会影响人工栽培中的产量（Wang等, 2023; Liu等, 2024）。因此，确定影响Armillaria菌根促进G. elata生长的因素非常重要。

在森林生态系统中，Armillaria定植在衰弱植物根部的形成层，导致宿主死亡，随后进入腐生阶段分解木材（Baumgartner等, 2011; Sahu等, 2023）。Lalande等人比较了高毒力Armillaria solidipes与低毒力Armillaria altimondiana以及健康树木的细菌组成，发现健康树木中更多含有Pseudomonadaceae和Spartobacteria，而死亡树木中更多含有Acidobacteria（Lalande等, 2019）。最新研究表明，许多大型腐生真菌在木质素分解过程中与细菌具有协同作用，细菌改变木材结构，使其更易被真菌分解（Bruez等, 2015; Embacher等, 2023）。此外，研究显示菌根中含有大量表达酶的细菌，可加速木材组织的分解（Przemieniecki等, 2021）。这些发现突显了细菌在宿主树木与Armillaria相互作用中的重要作用。刘等人从Armillaria的菌根土壤中分离出Rahnella菌株，并发现该菌株显著促进了Armillaria的生长并增加了G. elata块茎的大小（Liu等, 2022）。我们假设菌根内生细菌可作为Armillaria与G. elata共培养能力的生物指标。

在本研究中，我们从中国昭通（G. elata的主要生产地）收集了与其共生的Armillaria菌根，通过高通量16S rRNA测序分析了菌根内生细菌群落的差异。随后分离并鉴定内生细菌，并评估了其促进Armillaria生长的能力。通过Armillaria与G. elata的共培养实验筛选出能促进Armillaria生长并提高G. elata产量的内生细菌。我们推测：(1)Armillaria菌根中栖息着多种内生细菌；(2)Armillaria的遗传背景和土壤特性会影响内生细菌群落；(3)内生细菌的生长特性会影响其与Armillaria和G. elata的相互作用。

样本采集

Armillaria菌根由当地农民在七个种植点采集，这些地点位于海拔800–2500米的山地阔叶林或混交林中。种植前三个月准备了G. elata的真菌培养池，尺寸为70厘米（长）× 50厘米（宽）× 30厘米（深）。选用直径12–15厘米的壳斗科树木木材，切成20厘米长的段，间隔3–4厘米种植。

Armillaria及菌根内生细菌群落结构的特征分析

随着测序深度的增加，13个Armillaria菌根样本的物种丰富度和多样性达到饱和，表明采样和测序深度足以捕获样本中的大多数物种和多样性（图S2）。

基于IGS和IGS + ITS基因序列构建了系统发育树，结果显示13个Armillaria菌株可分为四组。

讨论

与无叶绿素兰花共生的菌根真菌可能经历了类似的基因组适应性，以支持内生生活方式（Kaur和Sharma, 2021）。与G. elata共生的Armillaria物种的基因组测序支持了这一假设。与更具致病性的Armillaria物种相比，致病性较低、主要为腐生的物种（如A. gallica和A. cepistipesG. elata形成共生关系（Guo等

结论

本研究旨在探讨菌根内生细菌与Armillaria和G. elata之间的相互作用。高通量测序和培养结果显示，与G. elata共生的Armillaria菌根中含有丰富的内生细菌。在门水平上，Proteobacteria的数量最多，其次是Firmicutes。还分离出了常见的促进植物生长的细菌，如Viridibacillus（12.24%）、Rahnella（6.12%）和Peribacillus（4.08%）。

资金来源

本研究得到了云南省生物资源保护与利用国家重点实验室开放研究计划（2024KF001）、国家自然科学基金（31960288）和云南大学研究生创新研究基金（KC-23235551）的支持。

未引用参考文献

(Van der Heijden等, 2015)

CRediT作者贡献声明

李宇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、概念构建。金晓涵：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、概念构建。张汉波：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金申请、方法设计。何海燕：

致谢

我们衷心感谢云南大学的曾赵英、李金鹏、程璐和杨爱玲在实验过程中的慷慨支持和技术协助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。