一种基于深共晶溶剂的抗氧化剂前体一步微萃取和水解方法，该方法应用于特级初榨橄榄油中，并结合毛细管电泳分析技术进行检测

《Microchemical Journal》：A deep eutectic solvent-based one-step microextraction and hydrolysis of antioxidant precursors in extra virgin olive oil coupled to capillary electrophoresis analysis

一种基于乙醛深熔盐溶剂的微萃取-酸解一体化方法用于测定橄榄油中的羟基酪醇和酪醇，通过硫酸酸化实现抗氧化前体的同步分解与提取，毛细管电泳检测显示回收率94±7%，检测限分别为40和60μM，显著优于传统方法且环保高效。

　　

Michele Abate | Eleonora Dametto | Gino Bontempelli | Nicolò Dossi

可持续分析仪器实验室（Sustain Lab），乌迪内大学农业食品、环境与动物科学系，意大利乌迪内Cotonificio街108号，邮编I-33100

摘要

本文提出了一种一步法微萃取和水解方法，用于毛细管电泳测定特级初榨橄榄油中的抗氧化剂羟基酪醇（HTy）和酪醇（Ty），这些抗氧化剂是从其前体释放出来的。该方法基于使用乙alin（一种由氯化胆碱和乙二醇以1:2摩尔比制备的深共晶溶剂），并加入1摩尔浓度的硫酸，从而将这些酚类化合物从其作为复杂化学结构中结合形式存在的前体中释放出来。

通过首先使用添加了抗氧化剂的种子油样品，随后使用特级初榨橄榄油（EVOO）样品，评估了所开发方法的性能。在测试中确定的优化条件下，使用乙alin进行水解过程能够获得满意的结果，产率约为94±7%，电泳测定的检测限为：HTy为40 μM，Ty为60 μM（信噪比为3）。所提出方法的结果与文献中报道的先提取后水解再通过色谱法测定HTy和Ty的方法进行了比较。该方法能够使用最少的试剂快速高效地从油中提取抗氧化剂，并且显著缩短了时间，最重要的是避免了溶剂蒸发的问题。因此，它可能成为目前常用方法的有效替代方案。

引言

近几十年来，分析化学经历了重大变革，以满足环境可持续性的需求。这导致了一系列变化，这些变化影响了分析过程的各个步骤，从样品制备到检测，这些变化总结在绿色分析化学（GAC）的12项原则中[1]、[2]、[3]。因此，出现了新的萃取方法，如固相和液相微萃取，这些方法显著减少了传统萃取方法中使用的样品量和溶剂体积，而传统方法往往耗时较长、对操作人员不安全且在废物管理方面复杂[4]、[5]、[6]。此外，微萃取方法可以与在非常低流速下运行的分离系统结合使用，例如超高效液相色谱（UHPLC），或者能够处理极小样品体积（<10 nL）的方法，如毛细管电泳（CE）[7]、[8]、[9]。然而，即使采用了这些减少溶剂使用的技术，也并非完全决定性。实际上，在某些生产环境中，例如食品工业，即使使用少量的有机溶剂也会带来一系列问题，这些问题不仅与废物的处理有关，还与储存有关。

为了克服这些缺点，人们提出了替代溶剂，如生物乙醇、2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）、1,3-丙二醇和萜烯（d-柠檬烯、β-蒎烯、p-伞花烃）[10]、[11]、[12]。在这方面，深共晶溶剂（DESs）是一种环保的替代品，它们是由两种或更多成分混合而成的低熔点混合物，这些成分可以在不同的摩尔比下形成氢键，具有低蒸气压、不易燃、高热稳定性和低热导率的特点[13]、[14]、[15]。

DESs已被用于多种应用，如固相微萃取（SPME）、搅拌棒吸附萃取（SBSE）、中空纤维液相微萃取（HF-LPME）和液相微萃取（LPME），旨在回收酚类化合物、黄酮类、金属离子和食品污染物[16]、[17]、[18]、[19]。选择最适合高效萃取的DES取决于多种性质，包括熔点、密度、粘度、表面张力和极性，这些性质又受到DES中存在的成分及其摩尔比的影响。特别是在将DESs用作LPME萃取介质的情况下，其低粘度至关重要，因为这可以最大化传质速率和效率，同时简化了使用微量注射器时的过程管理，这在这些萃取过程中非常常见[20]、[21]、[22]、[23]。

此外，DESs不仅可以作为萃取介质使用，还可以用于水解过程，以分解分析物以游离形式存在的复杂化合物[24]。例如，羟基酪醇和酪醇就是重要的抗氧化剂，常用于认证特级初榨橄榄油（EVOO）的营养和健康质量。它们通常以糖基化鞣花酸的酯形式存在，如橄榄苦苷和利格斯特罗苷。由于抗氧化活性与这些抗氧化剂浓度之间的关系，欧盟委员会在2012年发布了一项法规（Reg. CE n°432/2012）[25]、[26]，允许对EVOO的多元酚含量进行健康声明。该声明内容为：“橄榄油中的多元酚有助于保护血液脂质免受氧化应激”，并附带以下使用条件：“该声明仅适用于每10克橄榄油含有至少5毫克羟基酪醇及其衍生物（如橄榄苦苷复合物和酪醇）的橄榄油。为了说明这一声明的有效性，应向消费者说明每天摄入20克橄榄油即可获得益处。”

文献中报道了多种从EVOO中提取酚类化合物的方法。大多数方法通常包括一个萃取步骤，通常使用水-甲醇溶液（40,60或20,80 v/v）进行萃取，随后在酸性环境中使用高浓度（1或2 M）的硫酸或盐酸进行水解，以打破含有这些酚基团的化合物中的酯键。所得提取物随后通过气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）进行分析，通常采用280 nm波长的UV/vis检测器[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。然而，也有一些方法避免了原始EVOO中酚类化合物的水解，仅依赖于从橄榄油中提取多元酚[32]、[33]。

本研究的目的是开发一种创新的微萃取和水解一步法，该方法使用酸化的DES与CE分析相结合，用于测定EVOO样品中的HTy和Ty。这种方法允许使用环保的萃取介质和更少量的样品。特别是使用了乙alin作为DES，这是一种研究最广泛的DES，由氯化胆碱和乙二醇以1:2摩尔比制备[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。在加入1 M H₂SO₄后，使用这种萃取剂实现了HTy和Ty结合形式的同步水解和萃取。为了赋予DES酸性，我们选择向乙alin中添加硫酸，而不是用其他氢键供体（HBD）如对甲苯磺酸或三氯乙酸替换乙二醇，从而使用低粘度的DES[40]、[41]、[42]。通过将所提出的方法应用于橄榄苦苷（作为酯化物种的模型）来验证所采用的萃取介质进行酯化形式HTy和Ty水解的有效性。水解和萃取过程之后，通过毛细管电泳对HTy和Ty进行分析，该方法特别适合分析小样品体积，因此特别适用于微萃取样品的分析。下面报告了所采用分析方法的性能，该方法也应用于实际的EVOO样品。

试剂和仪器

试剂和仪器

水溶液由Purelab Flex 3系统（Elga，High Wycombe UK）制备的去离子水制成。

羟基酪醇（C₈H₁₀O₃，≥98.0%）、酪醇（C₈H₁₀O₂，98.0%）、对苯二酚（C₆H₆O₂，≥99.0%）、橄榄苦苷（C₂₅H₃₂O₁₃，≥98.0%）、乙酸乙酯（C₄H₈O₂，99.9%）、无水乙二醇（C₂H₆O₂，99.8%）、氯化胆碱（C₅H₁₄ONCl，≥98.0%）、戊烷（C₅H₁₂，≥99.0%）、硫酸（H₂SO₄，98.0%）、甲醇（CH₃OH，≥98.0%）、氢氧化钠（NaOH，≥98.0%）、无水二氢化钠

HTy和Ty的CE分析条件

如引言部分所述，本研究的目的是测试使用极少量的样品和DES乙alin作为萃取剂来微萃取和分解特级初榨橄榄油中存在的抗氧化剂前体的可行性。因此，需要采用适合检测在此过程中释放的微量HTy和Ty的分析方法。为此，认为毛细管电泳是一种合适的方法

结论性意见

本文提出的在乙alin中进行的微萃取和水解方法能够以最少的试剂量（100 μL的DES）从特级初榨橄榄油中释放和提取HTy和Ty，因此具有高度的环境友好性。此外，操作简单性和较短的萃取时间也使其非常实用，与传统方法相比大大缩短了时间，这得益于省略了预浓缩步骤

CRediT作者贡献声明

Michele Abate： 方法学、研究、数据分析。

Eleonora Dametto： 方法学、研究、数据分析。

Gino Bontempelli： 文章撰写与编辑、数据分析。 Nicolò Dossi： 文章撰写与编辑、初稿撰写、监督、资金获取、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。