基于“质量源于设计”（Quality by Design, QbD）原则，开发并验证了一种环保型液相色谱-质谱联用（LC–MS/MS）方法，用于环磷酰胺（cyclophosphamide）和卡培他滨（capecitabine）的药代动力学分析

《Microchemical Journal》：Development and validation of an eco-friendly LC–MS/MS method for pharmacokinetic profiling of cyclophosphamide and capecitabine using quality by design principles

环磷酰胺与卡培他滨的LC-MS/MS QbD方法开发及药代动力学研究，通过DoE优化关键参数，验证了线性、精度、准确性和稳定性，并评估方法绿色性，显示其环保性能优异。

　　

作者：Manoharan Murugesan, R. Gandhimathi

印度泰米尔纳德邦金奈Pallavaram市Vels科学、技术及高级研究学院（VISTAS），邮编600117

摘要

采用质量源于设计（Quality by Design, QbD）的方法，开发并验证了一种稳健、选择性强的环境可持续型液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时定量大鼠血浆中的环磷酰胺（cyclophosphamide）和卡培他滨（capecitabine）。通过实验设计（Design of Experiments, DoE）框架系统优化了关键方法参数，包括流动相组成、流速和pH值，以实现高灵敏度、选择性和重复性。在QTRAP? 5500质谱仪上，结合选择性反应监测（Selective Reaction Monitoring, SRM）技术，通过以下质荷比（m/z）实现了精确定量：环磷酰胺为262.08 → 170.01，卡培他滨为360.35 → 220.01，内标为195.15 → 100.32。方法验证表明其符合国际标准，证明了线性、精度、准确度、回收率和稳定性。该方法被应用于雄性Wistar大鼠的单次给药药代动力学研究。结果显示，环磷酰胺的最大血药浓度（C_max）为9.186 ng·mL^-1，达到峰值时间（T_max）为2.5小时，药时曲线下面积（AUC??∞）为42 ng·h·mL^-1，半衰期（half-life）为5小时；而卡培他滨的最大血药浓度为183.462 ng·mL^-1，T_max为2小时，AUC??∞为621 ng·h·mL^-1，半衰期为4小时，表明其系统暴露量更大且清除速度更快。在不同储存和处理条件下的稳定性评估证实了该方法的可靠性。可持续性评估显示该方法具有环保特性：综合绿色分析程序指数（ComplexGAPI）表明其参数对环境友好；分析绿色性评估（Analytical GREEnness, AGREE）和AGREEprep得分分别为0.70和0.69，体现了对绿色分析化学原则的严格遵守；生态规模评估（Eco-Scale）将其评为“优秀”（得分76）；蓝色适用性等级指数（Blue Applicability Grade Index, BAGI）显示该方法在绿色性和分析性能之间取得了最佳平衡。本研究建立了一种经过验证的、环保的LC–MS/MS平台，适用于抗癌治疗的药代动力学和生物等效性研究。

引言

环磷酰胺和卡培他滨是作用机制互补的常用化疗药物，常联合用于乳腺癌和其他实体瘤的治疗[1][2]。环磷酰胺（图1a）是一种氮芥类烷化剂，通过形成共价DNA交联来抑制细胞复制和转录，最终导致快速分裂的肿瘤细胞凋亡。由于其广泛的治疗谱，它仍然是辅助治疗和转移性癌症的主要药物。然而，由于其剂量限制性的毒性（包括骨髓抑制、免疫抑制和潜在的心脏毒性）[3][4]，临床使用时需要仔细优化剂量并密切监测。

卡培他滨（图1b）是一种口服给药的5-氟尿嘧啶（5-FU）前体药物，经过一系列酶促转化后，通过胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase）的选择性激活而发挥作用。生成的5-FU抑制胸苷酸合成酶（thymidylate synthase），从而破坏DNA合成和修复，实现对恶性组织的选择性杀伤[5]。与静脉注射5-FU相比，卡培他滨具有更高的患者依从性、更低的系统毒性和更好的生活质量，常用于转移性乳腺癌和结直肠癌的治疗，尤其是对传统治疗方案无效的患者[6][7]。

环磷酰胺和卡培他滨的固定剂量组合（Fixed-Dose Combination, FDC）通过结合烷化作用和抗代谢作用机制，提供了一种合理有效的疗法，可能产生协同抗癌效果[8][9]。商业产品如Comcapsy（含400 mg环磷酰胺和20 mg卡培他滨）证明了这种组合的临床价值及其简化治疗和提高患者依从性的潜力。尽管这两种药物在临床应用中越来越普遍，但目前仍缺乏同时测定其含量的可靠分析方法。准确的定量对于质量控制、稳定性研究和药代动力学评估至关重要，因为它能确保治疗监测的可靠性和法规合规性。

液相色谱与串联质谱（LC–MS/MS）结合使用是一种强大的分析技术，因其高灵敏度、选择性和快速分析能力而被广泛应用于多药同时测定[10][11]。本研究将开发并验证一种简单、稳健且灵敏的LC–MS/MS方法，用于大鼠血浆中环磷酰胺和卡培他滨的同时测定，以用于药代动力学研究。该方法将采用质量源于设计（QbD）方法，并通过实验设计（DoE）策略进行关键分析参数的系统识别和优化，从而提高方法的可靠性、重复性和法规接受度[12][13]。

此外，考虑到环境可持续分析实践的重要性，所开发的方法将基于绿色分析化学（Green Analytical Chemistry, GAC）原则进行评估。将应用多种绿色性评估工具，如分析绿色性评估（AGREE）、AGREEprep、分析生态规模评估（Analytical Eco-Scale）、综合绿色分析程序指数（ComplexGAPI）以及蓝色适用性等级指数（BAGI），以确保该方法在实现高分析性能的同时，最小化环境影响、减少溶剂消耗并促进可持续性[14][15]。总体而言，本研究旨在开发一种经过验证的、基于QbD原理的环保型LC–MS/MS方法，适用于环磷酰胺和卡培他滨的同时测定，既可用于药品质量控制，也可用于临床前药代动力学研究。

化学物质和试剂

环磷酰胺、卡培他滨和替莫唑胺（temozolomide，纯度≥99%）的参考标准品购自印度班加罗尔的Biocon Limited公司。LC–MS级溶剂（乙醇、乙腈和三氟乙酸TFA）购自印度孟买的Merck公司。超纯水使用Milli-Q纯化系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）制备，并用于所有实验。其他所有化学物质和试剂均为分析级，按收到状态直接使用。

关键方法变量的风险评估

为确保开发出一种稳健且可重复的LC–MS/MS方法，用于同时定量环磷酰胺和卡培他滨，在QbD框架内实施了系统的风险评估策略。该方法结合了初步方法探索的结果和文献中的证据，识别出可能影响方法性能的变异来源。共识别出20多个风险因素，并将其分为六类。

结论

采用质量源于设计（QbD）方法，开发并验证了一种稳健且环境可持续的LC–MS/MS方法，用于大鼠血浆中环磷酰胺和卡培他滨的同时定量。关键方法参数（流动相组成、流速和pH值）经过系统优化，以确保高选择性、灵敏性和重复性。方法验证符合国际法规对选择性、精度和准确性的要求。

CRediT作者贡献声明

Manoharan Murugesan：负责撰写初稿、软件开发、实验设计、资金获取、数据分析、概念构思。 R. Gandhimathi：负责审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化、项目监督、资源协调及概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者衷心感谢Vels科学、技术及高级研究学院（VISTAS）药学科学与分析系提供的必要研究设施，这些设施为本研究的成功提供了支持。