《Microchemical Journal》：Screening of aptamers for patulin in apple juice and construction of a new matrix tolerant sensor
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本研究提出一种苹果汁基质辅助的aptamer筛选策略，通过捕获SELEX结合基质筛选缓冲液，成功获得七种对苹果汁基质干扰具有抵抗性的PATaptamer。其中非A2 aptamer在基质与溶液中亲和力均值为3.59 μM，构建的荧光传感器检测限达0.15 μM，并在三种市售苹果汁（10%、25%、50%）中保持稳定性能。
Jiaxin Cheng|Feng Ye|Xinyue Zhang|Shixin Liu|Xingxing Yang|Bingzhi Wang|Yongshu Li|Xiaoyue Xiao|Huan Liu|Qin Wu|Jianjun Hou|Wudan Cai|Xixia Liu
湖北省食用野生植物保护与利用重点实验室，湖北师范大学，湖北省黄石市435002，中国
摘要
通过捕获-SELEX方法在溶液中筛选出的适配体在基质中往往会出现性能下降的问题。本研究旨在提出一种基于基质的捕获-SELEX策略，以筛选出抗基质干扰的适配体，以patulin (PAT) 适配体的筛选为例进行探讨。基质的选择使用了苹果汁配置的基质-SELEX缓冲液。所获得的适配体通过等温滴定量热法 (ITC) 在基质中进行滴定分析。利用尿素酶方法分析了抗基质适配体的关键区域。构建了一种基于适配体的耐基质荧光传感器，并在多种商业基质中进行了评估。结果显示，四个筛选库共鉴定出7个候选适配体。ITC 测量表明，非A2适配体在基质和溶液中的亲和力相似（3.59 μM），而在溶液中亲和力较高的其他适配体在基质中的亲和力下降了约10倍。非A2传感器的 Kd 值为13.68 μM，检测限为0.15 μM。在三种不同品牌和浓度（10%、25%、50%）的苹果汁中观察到了相似的性能。本研究提供了一种新的基于基质的筛选策略，为苹果汁中PAT的检测提供了一种耐基质传感元件。
引言
Patulin (PAT) 是由青霉菌属真菌产生的一类次生代谢物。它常见于发霉的水果中，尤其是苹果，并对动物具有致癌和致畸毒性 [1]、[2]。调查显示，PAT 污染在食品产品中仍然存在 [3]、[4]。因此，迫切需要开发一种有效的分析方法来准确且灵敏地检测食品基质中的 PAT。
适配体是通过指数富集法系统进化得到的单链DNA (ssDNA) 或 RNA [5]。通过体外筛选可以获得高亲和力的适配体。适配体具有多种独特优势，如易于修饰和合成 [6]、[7]、[8]。基于这些优势，已经开发出了多种适配体传感器，包括电化学传感器、荧光传感器和比色传感器 [9]、[10]、[11]、[12]、[13]。电化学传感器具有高灵敏度，但需要电极支持，结构相对复杂。比色传感器中常用金纳米粒子，但它们容易受到小分子的干扰 [14]。荧光传感器结构简单，因其便捷性和高效性而被广泛研究 [15]。然而，实际样品在FAM发射光谱中具有强烈的背景荧光。因此，选择合适的荧光标记非常重要。
许多小分子适配体已经成功筛选出来 [16]、[17]、[18]，但它们的实际应用仍然有限。根本原因在于实际环境中的小分子存在复杂性，这种复杂性会影响检测过程中的一个或多个步骤 [19]、[20]。大多数适配体筛选或表征研究都是在溶液环境中进行的，甚至包括缓冲液的优化 [21]。这是因为离子浓度和pH值会影响适配体的亲和力和特异性 [22]。检测环境与实际遇到的基质环境有很大差异 [23]。此外，我们的初步研究发现，食品基质对适配体传感器有显著影响 [19]、[24]。这意味着适配体在溶液中的高亲和力在基质中可能无法体现。研究人员已经意识到这个问题并正在尝试解决。例如，Ding等人 [25] 使用牛奶辅助筛选sarafloxacin适配体，以实现筛选和实际检测系统之间的一致性，并发现使用稀释20倍的牛奶作为缓冲液可以进行基于基质的筛选。尽管在筛选过程中加入了基质，但后续的表征并未在基质存在的情况下进行。Zhou等人 [26] 发现，之前筛选和分离出的Arah1适配体在复杂的食品基质中的结合效率有限，因此他们重新进行了筛选。新获得的适配体即使在含有80%（w/w）总花生蛋白的复杂基质中也能保持相当的结合亲和力。研究人员在筛选过程中增加了基质的压力，但添加的基质被稀释了，导致基质压力相对较低。
鉴于关于适配体在基质中的研究有限，本研究旨在筛选针对苹果汁中PAT的适配体。在苹果汁中对候选适配体进行了表征，以评估其抗基质能力。利用尿素酶方法分析了抗基质适配体的关键区域，并将其与适当的荧光基团结合，构建了抗基质干扰的传感器。
材料
PAT 标准品购自Pribolab（中国青岛）。链霉亲和素树脂购自Smart Life Sciences（中国常州）。尿素酶（来自杰克豆）购自Yuanye Biological（中国上海）。Taq聚合酶和dNTPs购自Takara（日本滋贺）。DNA由上海Biotech（中国上海）合成。
针对PAT的适配体基质筛选
该方法基于Huang和Liu [27] 的方法，并进行了一些修改。首先，将结合了生物素化引物的文库（文库: 引物 = 1:3）加入柱子中
针对PAT的适配体基质筛选
基质筛选策略如图S1所示。使用经过生物素修饰的引物，文库能够高效地固定在链霉亲和素树脂上。与目标固定筛选方法相比，这种方法保留了目标的原始结构，有利于筛选高亲和力和特异性的适配体。筛选过程中文库的保留监测结果如图1A所示。
结论
总之，建立了四种基质筛选的洗涤和洗脱模式，并通过这一过程成功获得了抗基质干扰的PAT适配体。通过基质筛选获得的非A2适配体（Kd = 3.59 μM）与通过溶液筛选获得的适配体进行了比较，证明了其抗基质能力。利用尿素酶方法分析了非A2在基质中保持高亲和力的关键区域。
CRediT作者贡献声明
Jiaxin Cheng：撰写——原始草案、可视化、方法学、数据分析、概念化。Feng Ye：验证、数据分析。Xinyue Zhang：方法学、概念化。Shixin Liu：验证、方法学。Xingxing Yang：验证、方法学。Bingzhi Wang：可视化、方法学。Yongshu Li：方法学。Xiaoyue Xiao：验证、资源准备。Huan Liu：可视化、项目管理、方法学。Qin Wu：验证、资源准备。Jianjun Hou：
资助
本工作得到了湖北省中央政府指导的地方科学技术发展项目（资助编号：2024BSB020、2025CSA104）、黄石市科技创新团队（资助编号：CXPT2023000007）、湖北省教育厅科研计划重点项目（资助编号：D20222503）、湖北省中央委员会指导的地方专项项目（资助编号：2023EGA041）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
