EMT/FAU纳米沸石在保护细胞免受活性氧损伤以及研究其对分离线粒体呼吸作用影响方面的多方面应用

《Microporous and Mesoporous Materials》：Multifaceted applications of EMT/FAU nanozeolites for protection against reactive oxygen species and their impact on the respiration of isolated mitochondria

纳米级EMT/FAU沸石合成及其表面氨基修饰对活性氧（ROS）抑制的影响。通过SEM、TEM、XRD和N2吸附分析表征沸石结构，发现氨基接枝使比表面积从620降至390 m2/g。Fenton反应模型显示控制组沸石（1 mg/mL）对水杨酸降解抑制达84%，而氨基接枝组仅34%，表明表面化学和表面积变化共同影响ROS清除。使用脑、心、肝、肾髓质线粒体进行实验，证实沸石未显著抑制线粒体呼吸，但高浓度氨基接枝沸石使脑和心脏线粒体过氧化氢增加，可能与颗粒聚集有关。本研究首次揭示表面修饰对线粒体功能影响的差异性。

　　

加姆泽·伊尔汉（Gamze Ilhan）|安妮·劳雷·查尔斯（Anne Laure Charles）|保琳·西尔维斯特兰（Pauline Silvestrin）|阿莉泽·海特（Alizée Heit）|瓦西利基·帕帕埃夫蒂米乌（Vasiliki Papaefthimiou）|伯纳德·热尼（Bernard Geny）|贝努瓦·路易（Beno?t Louis）|加埃坦·卢茨韦勒（Ga?tan Lutzweiler）

ICPEES，可持续环境能源与燃料团队，UMR 7515 CNRS，斯特拉斯堡大学-ECPM，67087，斯特拉斯堡，法国

摘要

为了设计一种悬浮液以解决多种病理状态下产生的活性氧（ROS）问题，合成了纳米级的EMT/FAU型沸石。通过SEM、TEM、XRD和N₂吸附-脱附测量对沸石进行了表征。此外，这些沸石还接上了胺基团，这是纳米粒子表面功能化的常用方法，但胺基团与ROS上调之间的因果关系仍存在争议。沸石的表面功能化是通过用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）进行硅烷化实现的，这使得比原始沸石（对照组）的比表面积从620 m²/g降低到390 m²/g。XPS研究证实了胺基团的成功接枝。首先在Fenton反应中测试了沸石清除或抑制ROS的能力，评估了在沸石存在下探针分子（如水杨酸）的降解程度。结果显示，在1 mg/mL的浓度下，对照沸石的最大保护效果为84%，而接有胺基团的沸石仅提供34%的保护。相比之下，不使用沸石时保护效果仅为16%，这表明表面修饰具有显著效果，这与表面化学性质和可用表面积有关。最后，将来自四种不同组织（大脑、心脏、肝脏和肾脏髓质）的线粒体与沸石混合，测量了在不同剂量（0.01至1 mg/mL）下线粒体的氧气消耗和过氧化氢的产生情况。未发现线粒体呼吸受到显著影响，表明沸石具有无害性。在较高剂量下，接有胺基团的沸石在大脑和心脏线粒体中显示出过氧化氢水平升高的趋势，而对照组则没有类似现象。这可能是由于高浓度下颗粒聚集导致的质量传输限制。因此，本研究展示了纳米级沸石在模型反应中降低ROS水平的能力，并首次使用分离的线粒体证明了线粒体功能与沸石功能化之间的器官特异性关系。

引言

在体内，有多种机制可以减轻与氧化应激相关的不良影响，但在某些情况下（如缺血-再灌注或慢性伤口[1]），活性氧（ROS）的生成会增加，从而导致细胞损伤。例如，过氧化氢（H₂O₂）在细胞呼吸过程中产生，但在缺血-再灌注损伤时会积累，进而成为细胞凋亡的主要原因[2]。

过氧化氢（H₂O₂）是细胞呼吸的副产物，也是许多酶促反应的底物。其浓度通常保持在较低水平以避免不良影响。尽管H₂O₂在化学上相对惰性（由于其高能量屏障[3]），但它仍可以通过金属催化的氧化反应损伤酶，例如在过渡金属（如Fe(II)）和氨基酸残基之间形成复合物。该复合物会激活H₂O₂，产生的自由基具有高度反应性，可以在多个位点与酶反应[4]。结果可能导致蛋白质羰基化和/或脂质过氧化，从而引起受影响组织的严重功能障碍[5]。H₂O₂在金属作用下产生的羟基自由基被称为Fenton反应，其最简单的表达式为：$F{e}^{2+}+H_2{O}_2?O{H}^{?}+F{e}^{3+}$

然而，在体内，其他金属（如铜）也可能发生类似的反应，这种情况下称为“类Fenton”反应。此外，反应过程通常更为复杂，涉及铁复合物而非自由离子，这也改变了能量景观[6]。尽管如此，Fenton反应仍然是体外产生ROS的合适模型。许多研究试图通过开发创新材料（如多羟基醛酸酯纳米粒子）来解决H₂O₂过表达的问题，这些材料能与H₂O₂反应生成CO₂，且这种反应具有剂量依赖性[7]。此外，聚合物纳米粒子可以轻松调节以结合和保护抗氧化剂或酶，从而延长其在目标组织中的半衰期和生物活性。例如，超氧化物歧化酶（SOD）通过静电结合到阳离子嵌段共聚物上[8]，也可以在脂质体表面实现固定[9]。另一项研究中，过氧化氢酶（CAT）被PEG化并与Mn-卟啉结合以触发ROS的还原[10]。Guan等人[11]最近综述了纯金属纳米粒子（包括铂、钼、金或碳）的强抗氧化效果，这些纳米粒子的ROS中和能力与其与酶活性位点的相似性有关，但作者也指出它们具有潜在的危害性和毒性问题仍需解决。

过去十年中，沸石在生物医学领域的应用受到了越来越多的关注，这主要归功于它们较大的表面积、强大的阳离子交换能力，以及多种合成方法，可以调节其形态、孔径和晶体大小[12]。例如，当需要注射沸石悬浮液时，这些特性尤为重要，因为沸石既不能沉淀也不能积累，而纳米级沸石正好满足这种胶体稳定性要求。例如，纳米级FAU型沸石可以静脉注射用于治疗胶质母细胞瘤[13,14]。还提出了通过加载铈离子来模拟SOD和CAT活性来中和ROS的方法[15]。在大鼠模型中，作者发现沸石既能中和ROS又能局部调节Zn²⁺浓度，从而保护细胞，尤其是紧密连接蛋白。Pellegrino等人的早期工作[16]表明，FAU型沸石可将Fenton反应产生的OH^-减少65%，他们认为OH^-自由基可以进入沸石通道，从而限制白蛋白的氧化，尽管其失活机制尚未明确。此外，结构类似于沸石的MOFs（如沸石咪唑框架-8）也可以通过加载铂[17]、过氧化氢酶[18]或SOD[19]来实现ROS中和。因此，沸石或其衍生物清除或中和ROS的能力主要取决于所负载金属的反应性。

在这项研究中，我们受到了Pellegrino等人[16]研究的启发，首先合成了纳米级沸石以确保其胶体稳定性，并且仅使用钠作为结构导向剂，不添加任何其他金属。然后，一部分沸石接上了胺基团，以便与标准沸石（即对照组）进行比较，对照组的外表面富含硅醇基团，以探讨表面化学性质对其清除体外Fenton反应产生的羟基自由基对探针分子（如水杨酸）氧化能力的潜在影响。选择胺基团首先是因为胺基团常用于纳米粒子表面功能化以清除ROS，但本身作为功能团的用途较少。有趣的是，有研究报道胺基功能化颗粒通过内吞体ROS信号通路具有减弱效应[20]，也有研究描述了其清除羟基自由基的能力[21]，尽管酚类或儿茶酚类基团具有更好的还原性，从而提供更好的抗氧化性能[22]。接下来，将所得沸石与分离的大脑、肾脏髓质、心脏和肝脏组织的线粒体混合[23]，首次研究了沸石对线粒体呼吸和过氧化氢生成的直接影响。因此，本研究旨在比较裸露（对照组）和接有胺基团的沸石作为ROS抑制剂或清除剂的潜力，在体外模型中使用了分离的线粒体作为器官模型，这是迄今为止尚未报道的。

部分摘要

沸石的合成与功能化

沸石的合成遵循了其他文献中描述的程序[24]。在聚丙烯瓶中准备了两种独立的溶液，并将总体合成混合物调整为9 Na₂O: 0.7 Al₂O₃: 10 SiO₂: 160H₂O的摩尔比。首先将0.573克氢氧化铝（Riedel-de Ha?n，CAS: 11138-49-1）溶解在4毫升超纯水中，搅拌以确保完全溶解。然后加入1.84克氢氧化钠（Fisher Scientific，CAS: 1310-73-2）

结果与讨论

合成的沸石首先通过SEM（图1a和b）和XRD（图1c）进行了表征，显微镜图像显示由纳米级晶体（300-500纳米）形成的微米级聚集体。单个晶体没有表现出典型的FAU型八面体形态，而是层状形态，这在没有添加剂的合成情况下通常归因于EMT/FAU类型的互生现象，通常由较低的结晶温度（70°C）或H₂O/Al₂

CRediT作者贡献声明

加姆泽·伊尔汉（Gamze Ilhan）： 方法学、研究、数据管理。安妮·劳雷·查尔斯（Anne Laure Charles）： 编写 – 审稿与编辑、监督、软件使用、资源管理、方法学。保琳·西尔维斯特兰（Pauline Silvestrin）： 方法学、研究、数据管理。阿莉泽·海特（Alizée Heit）： 资源管理、研究、数据分析。瓦西利基·帕帕埃夫蒂米乌（Vasiliki Papaefthimiou）： 编写 – 审稿与编辑、验证、监督、软件使用、研究、数据管理。伯纳德·热尼（Bernard Geny）： 编写 –

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

卢茨韦勒的报告由斯特拉斯堡大学提供。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢Thierry Romero提供的技术支持。