《Microchemical Journal》：Establishment of closed dumbbell mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of
Streptococcus agalactiae (GBS)
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基于闭合哑铃介导的等温扩增（CDA）技术建立了一种快速、灵敏的GBS（链球菌属）检测方法，检测限为10 copies，灵敏度和特异性均达100%，总耗时60分钟，适用于现场快速诊断。
张彦莉|陈旭涵|钟业玲|郭飞|陈永华|欧阳贵芳|毛瑞
中国浙江省宁波市宁波大学第一附属医院血液科，315010
摘要
统计数据显示，无乳链球菌（GBS）感染是导致发病率增加的原因，这给临床诊断和治疗带来了挑战。大量关于食用生淡水鱼或商业牛奶的报道表明，GBS存在较高的食源性传播风险。因此，本研究的目的是建立一种新型的封闭哑铃介导等温扩增（CDA）检测方法，该方法结合实时荧光技术和终点判断，在护理点实现GBS的快速诊断。通过验证外部引物，优化了CDA检测过程。建立特定的GBS CDA方法后，能够扩增目标DNA，并通过实时荧光曲线图、熔解曲线分析和终点颜色轻松获得结果。GBS的检测限（LOD）为10个拷贝，无GBS的样本未显示扩增信号。通过对560批不同DNA样本的评估，该检测方法的灵敏度和特异性均达到100%。此外，整个CDA检测过程仅需60分钟。总之，CDA检测工作流程为日常乳品监测、公共卫生控制和临床实验室中的GBS感染快速诊断提供了便利。
引言
B组链球菌（GBS），正式名称为无乳链球菌，属于Lancefield抗原分类系统中的唯一物种[1]。作为一种革兰氏阳性细菌，GBS具有兼性厌氧特性，是一种机会性病原体。其临床重要性在于它能够无症状地定植于人体胃肠道和泌尿生殖道[2]、[3]。GBS感染可引发多种严重临床疾病，包括败血症、脑膜炎、肺炎和心内膜炎，这些疾病对其疾病负担有显著影响[4]、[5]。为应对GBS带来的高发病率，美国在2002年修订了围产期预防策略，要求对所有孕妇进行普遍的基于培养的筛查。除了临床表现外，由于GBS的高传染性和在乳品群及受污染的生淡水鱼中的快速传播，它还带来了重大的食源性传播风险[6]、[7]、[8]、[9]。无疑，将快速GBS检测方法整合到现有的筛查方案中将对临床和公共卫生带来巨大价值[10]。迄今为止，GBS的检测方法已经从传统的基于培养的方法发展到现代分子工具[11]、[12]。尽管公认的基于培养的方法是GBS鉴定的金标准，但这些方法需要专业技术知识和较长的处理时间，可能会延误关键治疗[13]。研究人员证明，特定的生物分子信号识别和扩增方法（如聚合酶链反应（PCR）和抗原/抗体免疫测定）具有灵敏度和简便性[13]、[14]。尽管商业PCR试剂盒在中心实验室和医院中广泛可用[15]，但在资源有限的环境中，由于精密仪器成本高、操作复杂以及需要专门技术，这些方法的应用受到限制[16]。因此，开发快速、准确、用户友好且特异性的即时检测方法对于改善公共卫生，特别是在资源有限的环境中，具有重要意义[17]。Notomi及其同事在2000年报道的环介导等温扩增（LAMP）技术标志着分子诊断领域的重大进展，因为它能够在等温条件下实现DNA快速扩增，从而无需使用程序化热循环仪[18]。LAMP方法已成为实现核酸检测即时检测（POCT）的主要平台[19]。迄今为止，LAMP检测已被用于包括GBS在内的多种病原体的检测[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。尽管LAMP方法具有优势，但它依赖于由六个引物（内部引物、外部引物和环引物）组成的复杂系统。这种固有的复杂性不仅增加了引物设计难度，还提高了非特异性扩增的可能性，可能导致假阳性结果，从而影响诊断准确性[25]、[26]、[27]。此外，复杂的引物设计过程通常使得LAMP检测的开发和验证变得复杂[28]、[29]、[30]。这些缺点阻碍了LAMP方法的广泛采用和实际应用[31]。此后，许多研究尝试通过结合纳米粒子侧向流动生物传感器和CRISPR/Cas12a系统等技术来优化LAMP检测[32]、[33]、[34]。我们基于LAMP的原理，构思、开发并验证了封闭哑铃介导等温扩增（CDA）方法[35]。与LAMP相比，CDA通过使用简化的引物组合解决了引物设计复杂和非特异性扩增的问题。CDA引物通过在标准PCR引物的5′端添加两个不同的序列片段来设计，这大大降低了引物合成成本并简化了设计过程。CDA方法在扩增H1N1、志贺菌、Rickettsia raoultii、肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌、白色念珠菌等多种病原体方面的应用已得到验证[35]、[36]、[37]、[38]、[39]，同时也用于食品技术中的物种鉴定[40]。为了建立一种新的GBS检测平台，我们选择了其保守的DNA序列（GenBank登录号CP053027.1）作为目标，开发基于CDA的核酸扩增检测方法。我们系统地验证了GBS-CDA检测方法的分析性能，包括特异性、灵敏度和检测限（LOD）。将开发的GBS CDA检测方法与参考实时qPCR方法进行了LOD指标的比较分析。此外，通过实时荧光曲线和现场可见光监测，我们确认该检测方法的灵敏度和特异性均为100%。这些结果共同表明，所开发的GBS CDA检测方法是一种快速且经济有效的诊断方法。
部分内容
细菌菌株和细菌基因组DNA提取
本研究使用的所有细菌菌株均来自两个可靠的微生物资源库：中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）和Bena菌种保藏中心（BNCC）。本研究选取了九种细菌菌株，包括目标病原体无乳链球菌（GBS）（BNCC, 185941）以及八种非目标菌株：化脓性链球菌（BNCC, 102663）、肺炎克雷伯菌（BNCC, 338425）、肺炎克雷伯菌（BNCC, 361251）等
GBS检测的CDA检测方法设计
在CDA扩增的初始阶段（图1A），内部引物MF和MR引发等温反应，生成单链DNA产物，随后形成封闭的哑铃结构。在下一阶段，部分单链和双链的封闭哑铃DNA作为模板，通过MF和MR的退火和延伸或自我延伸机制进行指数级扩增
讨论
随着技术的快速发展，对高质量和健康生活的追求日益增强，精准医疗已成为当代医疗保健的前沿[45]。然而，全球健康和食品安全仍受到包括细菌、病毒和真菌在内的多种病原体感染的持续威胁[46]。快速准确地检测与疾病相关的生物标志物是及时有效应对这些威胁的前提[47]、[48]。体外
CRediT作者贡献声明
张彦莉：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念构思。陈旭涵：撰写 – 审稿与编辑、方法学。钟业玲：撰写 – 审稿与编辑、方法学。郭飞：撰写 – 审稿与编辑、方法学。陈永华：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。欧阳贵芳：撰写 – 审稿与编辑、监督。毛瑞：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学、概念构思。
伦理批准
临床DNA样本由宁波大学第一附属医院的研究团队于2023年10月至2024年5月期间收集，批准号为2024-055A-01（来自宁波大学第一附属医院临床研究伦理委员会）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本研究得到了浙江省疾病预防控制科学技术计划（资助编号：2025JK278）、浙江省重点产业计划（资助编号：2025C02247(SD2)、浙江省卫生健康委员会医疗卫生科学技术项目（资助编号：2022KY1113）、宁波血液系统恶性肿瘤临床研究中心（资助编号：2021L001）、宁波公益研究项目（2022S032）以及浙江省中医药的支持。
