基于DNA哑铃结构设计的CRISPR/Cas13a生物传感器，用于检测具有目标识别切割-连接-转录级联反应功能的人类糖基酶

《Microchemical Journal》：DNA dumbbell-switched CRISPR/Cas13a biosensor for detecting human glycosylases with target-initiated cleavage-ligation-transcription cascade

hOGG1酶活性检测新方法基于CRISPR/Cas13a系统，通过dumbbell DNA探针实现信号放大，灵敏达0.008 U/mL，并验证了在细胞和临床样本中的适用性及平台扩展性。

　　

Xinyi Xia|Yuanchao Qi|Xia Cheng|Qingshan Chen|Zhenyu Zhou|Wenchen Zhao|Yan Gu|Wenpei Dong|Hai Zhang

上海交通大学医学院附属上海第一妇产科医院母胎医学与妇科肿瘤学研究所上海母胎医学重点实验室药学系，中国上海

摘要

人类8-氧鸟嘌呤糖基化酶1（hOGG1）通过碱基切除修复机制来保护基因组的稳定性，从而修复氧化的DNA损伤。鉴于其关键作用，该酶的功能障碍是致癌的重要因素，因此hOGG1成为预后评估的宝贵生物标志物，以及早期检测和治疗的潜在靶点。本文介绍了一种基于荧光检测的hOGG1生物传感器，该传感器通过程序化的生化电路将目标识别转化为CRISPR/Cas13a的激活。hOGG1特异性地识别并从哑铃形DNA探针的8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）:C碱基对中切除8-氧鸟嘌呤，从而启动修复机制。随后，被切割的探针被转化为环状模板，驱动滚环转录（RCT）产生CRISPR RNA链。这些RNA产物被用来引导Cas13a对荧光报告分子的切割，产生明显的信号增强效果。通过利用自生成的crRNA依赖性CRISPR激活机制，该方法实现了出色的背景抑制，使得hOGG1的检测限达到0.008 μM。我们通过在不同细胞系和临床组织样本中测量hOGG1活性来验证了该方法的实用性。此外，通过简单重新设计哑铃形探针序列，该平台可以快速且等温地检测其他DNA糖基化酶，显示出广泛的适用性。这项工作为hOGG1分析提供了一种强大且多功能的工具，在分子诊断、癌症研究和药物开发领域具有显著潜力。

引言

人类基因组持续面临高水平的DNA损伤，每个细胞每天因环境和内源性因素而遭受超过100,000个细胞毒性损伤[1][2]。其中，氧化损伤是对基因组完整性的主要威胁[3][4]。作为碱基切除修复（BER）途径的关键组成部分，人类8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（hOGG1）在细胞防御此类损伤中起着关键作用[5]。具体而言，hOGG1识别并从8-氧鸟嘌呤：C碱基对中切除8-氧鸟嘌呤（8-oxoG），从而去除这种主要的、高度致突变的氧化产物[6][7]。作为基因组稳定性的重要守护者，hOGG1的功能不仅限于核DNA修复[8]，还涉及线粒体DNA的保护、调节细胞对氧化应激的反应以及减少易致癌突变[9][10]。值得注意的是，hOGG1活性的异常会损害损伤的准确清除，直接导致G:C到T:A的转换和基因组不稳定性的增加。鉴于其核心作用，hOGG1的失调与包括前列腺癌、肺癌、结直肠癌和胃癌在内的多种癌症的发病机制密切相关，使其成为重要的诊断生物标志物和潜在的治疗靶点[11]。这突显了其在癌症风险评估和预后评估中的临床价值。此外，从治疗角度来看，用抑制剂靶向hOGG1可以使癌细胞对氧化损伤诱导剂更加敏感，提示其作为化学增敏策略的潜力[12][13]。因此，准确量化hOGG1活性对于DNA修复机制的基础研究以及肿瘤学的临床应用具有重要意义。

传统的DNA糖基化酶检测技术主要依赖于免疫化学方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot和免疫组化[14][15][16]。尽管这些方法应用广泛，但通常耗时较长，涉及多个操作步骤，并且测量的是蛋白质水平而非酶活性。此外，它们往往缺乏常规诊断或高通量筛选所需的灵敏度和操作简便性，限制了在临床和研究环境中的应用[17][18]。为了解决这些问题，已经开发了一系列基于酶活性的生物传感器，将hOGG1介导的碱基切除转化为可测量的信号，包括拉曼光谱、比色法、荧光和电化学检测[19][20][21][22]。其中一些设计使用了含有8-氧鸟嘌呤：C碱基对的双链DNA探针。hOGG1的识别和切除会引发切割反应，释放出信号生成物质。尽管这些方法提供了直接的活性读数和简化的操作流程，但大多数系统基于“一种酶一个信号”的原则，限制了其对低丰度目标的检测灵敏度。因此，引入了信号放大技术来提高检测性能[23]。例如杂交链反应、链置换扩增、滚环扩增、引物交换反应和自导向环介导的等温扩增等方法已被用于将检测灵敏度提高到皮摩尔级别[24][25][26][27][28][29]。然而，酶介导的扩增方法容易受到非特异性背景扩增的影响，从而影响测定的准确性和重复性。

受高目标特异性和可编程性的启发，CRISPR-Cas系统已成为生物技术、基因编辑和分子诊断中不可或缺的工具[30][31][32][33]。Cas蛋白与CRISPR RNA（crRNA）形成核糖核蛋白复合物，特异性结合互补的核酸序列，触发切割反应[34]。其中，Cas12a和Cas13a在目标识别时表现出非特异性的旁路切割活性，能够在单一系统中快速放大信号[35][36]。基于CRISPR的生物传感器具有操作简单、反应条件温和、高特异性、高效扩增以及灵活的报告基因设计等优点，因为它们的切割活性不受序列限制[37]。典型的工作流程包括：（i）目标预扩增，（ii）CRISPR介导的识别，（iii）信号报告分子的旁路切割[37]。虽然最初用于核酸目标，但该系统已通过功能性核酸元件被改编用于检测非核酸分析物，将这些目标的识别转化为可扩增的DNA或RNA信号。由于Cas-crRNA-目标相互作用的高特异性，将CRISPR-Cas系统整合到hOGG1检测中可以有效抑制非特异性扩增引起的假阳性信号。目前大多数基于CRISPR的hOGG1检测平台使用Cas12a[38][39]。然而，Cas12a存在某些局限性，如酶活性有限，且受到前间隔区（PAM）序列的限制。为了提高灵敏度和特异性，探索具有改进特性的替代Cas效应子是有价值的。作为RNA引导的RNase，Cas13a在激活时表现出快速的旁路RNA切割活性，并已成功应用于病毒RNA和癌症相关转录本的超高灵敏度检测[40][41]。与Cas12a不同，Cas13a不需要PAM序列，在某些情况下具有更高的催化活性，并提供更好的特异性[42]。这些特性使得Cas13a成为构建下一代hOGG1生物传感器的理想候选者。迄今为止，尚未有研究将RCT与CRISPR-Cas13a结合用于hOGG1活性检测。

在这项工作中，我们开发了一种哑铃形切换的CRISPR/Cas13a生物传感器，该传感器具有自生成的crRNA依赖性Cas13a激活机制。系统从含有8-氧鸟嘌呤损伤的哑铃形DNA探针开始。hOGG1介导的碱基切除和随后的脱嘌呤/脱嘧啶（AP）位点切割产生了一个可连接位点，该位点通过T4 DNA连接酶封闭形成环状RCT模板。然后该模板由T7 RNA聚合酶转录，产生大量crRNA，这些crRNA与Cas13a结合并激活它。激活的Cas13a表现出旁路RNase活性，切割荧光淬灭的RNA报告分子，产生放大的荧光信号。该平台在复杂的生物基质（包括细胞裂解物和临床组织样本）中表现出高灵敏度、优异的特异性和稳健的性能。此外，模块化设计使其能够直接用于检测其他DNA糖基化酶，体现了其多功能性。我们预计这种基于CRISPR-Cas13a的策略将为分析DNA修复酶开辟新的途径，应用于癌症诊断和治疗开发。

材料和化学品

HPLC纯化的DNA和RNA寡核苷酸由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）提供，序列列于表S1（支持信息）中。hOGG1、hAAG、UDG、FEN1、Exo I、APE1、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP、10 mM DTT、pH 7.5）、T7 RNA聚合酶、RNAPol反应缓冲液（40 mM Tris-HCl、6 mM MgCl2、1 mM DTT、2 mM 脱氧核苷、pH 7.9）和rNTP混合物来自New England BioLabs（美国马萨诸塞州）。

哑铃形切换CRISPR/Cas13a生物传感器的工作原理

在本研究中，CRISPR/Cas13a系统既作为信号放大器，也作为报告模块用于检测hOGG1。传感机制在图1和图S1中进行了示意图描述。作为碱基切除修复途径的关键酶，hOGG1识别并切除双链DNA中的8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）损伤。为了利用这一活性，设计了含有嵌入8-氧鸟嘌呤残基的哑铃形功能探针（DFPs）。探针茎部的某一片段与Cas13a crRNA互补。

结论

总之，我们开发了一种哑铃形切换的CRISPR/Cas13a生物传感器，能够灵敏且特异性地检测hOGG1，该传感器具有自生成的crRNA依赖性Cas13a激活系统。在该系统中，hOGG1响应的哑铃形DNA探针被特异性切割并封闭成环状模板，从而触发滚环转录，产生大量crRNA，进而引发强烈的Cas13a旁路切割。通过准确量化hOGG1活性，证明了该传感器的实际应用价值。

CRediT作者贡献声明

Xinyi Xia：撰写——原始草稿、方法学设计、概念构思。 Yuanchao Qi：概念构思、撰写——审阅与编辑。 Xia Cheng：撰写——审阅与编辑、监督。 Qingshan Chen：资源获取、数据管理。 Zhenyu Zhou：验证、实验研究。 Wenchen Zhao：数据管理。 Yan Gu：撰写——审阅与编辑、监督。 Wenpei Dong：数据可视化、验证、方法学设计、实验研究。 Hai Zhang：撰写——审阅与编辑、监督。

伦理批准

已获得复旦大学华东医院伦理委员会的批准（2024 K020）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：62305207）、上海青年医药人才能力提升计划（项目编号：SPAQNRC2025A15）、国家青年医学创新研究项目（项目编号：P250530109214和P250320108852）、吴杰平医学基金会（项目编号：320.6750.2024-18-15）、医疗保健与健康发展促进计划研究资助项目（项目编号：FK202412）以及复旦大学华东医院基础研究促进项目的支持。