《Microchemical Journal》：A novel microfluidic immunosensing platform employing covalently immobilized carboxylated graphene quantum dots
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本研究开发了一种基于羧基化石墨量子点（CGQDs）的微流控免疫传感平台，通过EDC/NHS策略共价固定于硅烷化载玻片。经FTIR、UV-Vis、HRTEM等多维度表征，证实CGQDs/EDC/NHS底物具有更优的抗体固定化性能、高P/N比和重复性（CVs<5.2%），且长期稳定性良好（97天无显著信号衰减），为临床诊断和食品安全监测提供高灵敏度解决方案。
赵欣|李永红|黄健|林宏|李振星
中国海洋大学食品科学与工程学院，山东省青岛市三沙路1299号，266404，中华人民共和国
摘要
本研究开发了一种新型微流控免疫传感平台，称为CGQDs/EDC/NHS基底。该平台通过EDC/NHS策略将羧基化石墨烯量子点（CGQDs）共价固定在硅烷化载玻片上。利用FTIR、UV–Vis、PL、SERS、HRTEM、XPS、AFM和水接触角（WCA）测量方法，对CGQDs在活化前后的物理化学和结构性质进行了表征。通过微阵列分析，将抗体固定性能、非特异性吸附和重复性分别与聚赖氨酸间隔醛（PLLSA）和氧化石墨烯量子点（GOQDs）基底进行了比较。在10个独立批次中评估了批次内和批次间的重复性，并通过间接ELISA和夹心ELISA格式验证了免疫测定的可行性，所用蛋白质/抗体均通过SDS-PAGE和LC-MS/MS进行了验证。经过97天的储存后，重新测试以评估长期稳定性。
表征结果证实CGQDs成功活化，并引入了NHS酯基团，其在UV–Vis/PL光谱中显示出红移现象，荧光强度增强了约6倍。HRTEM显示平均粒径从2.14?±?0.29?nm增加到2.7?±?0.63?nm。最佳条件下的基底（0.125?mg/mL CGQDs）优于PLLSA和GOQDs基底，表现出适宜的亲水性、较低的非特异性吸附、较高的P/N（阳性与阴性）比值以及优异的重复性（CV<5.2%）。AFM观察到“岛屿-海洋”结构，提供了丰富的结合位点和疏水微域，有助于生物分子的定向固定。值得注意的是，该基底在储存97天后仍表现出极佳的长期稳定性，阳性信号没有显著衰减。本研究展示了一种基于CGQDs的高性能微流控平台，其在抗体固定性能、P/N比值和重复性方面均优于传统基底，为临床诊断和食品安全监测中的敏感免疫传感奠定了基础。
引言
由于纳米材料具有出色的物理化学性质，它们在生物医学、食品科学、化学分析、生命科学和航空航天领域得到了广泛应用[1]。作为生物传感识别元件的重要组成部分，纳米材料显著提升了传感器的分析性能、灵敏度和选择性[2]。在纳米材料中，量子点（QDs）因其可调的发光特性、量子限制效应和优异的光电化学性质而被认为是最具潜力的传感和检测候选材料之一。
石墨烯量子点（GQDs）是零维半导体纳米晶体，由1–5层sp2杂化碳原子组成，呈六角晶格排列[3]、[4]、[5]、[6]。它们具有单层或少层石墨烯晶体结构，横向尺寸通常小于10?nm。这种独特结构赋予了其与其他碳纳米材料（如碳纳米管、石墨烯和C60）不同的带隙特性和边缘效应[7]、[8]。GQDs的光电特性可以通过掺杂[9]、尺寸调控[10]和表面功能化[11]、[12]、[13]进行精确调节。值得注意的是，GQDs结合了传统量子点的基本物理化学性质（如可调的发射带隙和量子限制效应），同时具备优异的生物相容性和光稳定性[14]、[15]、[16]，在多种溶剂（包括水、乙醇、DMF和DMSO）中的高溶解性[17]，以及经济可行的合成方法[18]。作为一种新型荧光纳米材料，GQDs引起了广泛关注[19]、[20]。
作为GQDs的衍生物，氧化石墨烯量子点（GOQDs）是一种基于碳的荧光纳米材料，具有单原子层结构，横向尺寸为2–20?nm。其表面富含含氧功能团，具有优异的亲水性和在极性溶剂中的高分散性。此外，GOQDs因其出色的物理吸附能力、发光性质、低毒性和易于制备而在生物传感领域得到广泛应用。
羧基化石墨烯量子点（CGQDs）作为一种新兴的功能化碳基荧光纳米材料，越来越受到关注。它们保留了GQDs的典型结构特征（尺寸小于10?nm、sp2碳骨架和量子限制效应），同时在水中表现出显著增强的分散性、生物相容性和化学改性能力，这得益于其丰富的表面羧基团。与GOQDs相比，CGQDs在溶解性和界面兼容性方面更优，同时保持了低毒性、高稳定性和易于合成的优点。此外，CGQDs具有可调的荧光性、高比表面积以及与生物分子的共价结合能力。这些优点使得CGQDs成为构建高灵敏度和选择性生物传感器的理想选择，展现出在集成微流控系统中的广泛应用潜力。
微流控芯片系统（也称为“芯片实验室”）能够将化学和生物检测集成在一个平台上，具有超低检测限、同时检测多种生物标志物、高通量、短检测时间和低试剂消耗等优点[21]、[22]、[23]。自20世纪90年代提出以来，这项技术在生物医学、环境监测和药物筛选等领域展现了广阔的应用前景[21]、[22]、[23]。其核心原理是通过微米级通道精确操控流体，实现样品的快速、高效和高灵敏度分析及检测。
纳米材料的集成进一步提升了微流控传感性能。诸如氧化石墨烯（GO）、GOQDs、还原氧化石墨烯（rGO）和GQDs等纳米材料，由于其可调的荧光性、荧光淬灭效应、高比表面积和优异的生物相容性及易于功能化，被广泛应用于荧光开关传感器[24]、[25]、电化学发光/电化学传感器[26]和生物成像[28]中。将纳米材料引入微流控系统可以显著提高检测的灵敏度、可靠性和通量。例如，经过Ti?C?T?/Au纳米颗粒改性的表面声波微流控芯片可用于内毒素的高灵敏度检测[29]；基于Mn?O?–RGO纳米复合材料的微流控生物传感器对心肌肌钙蛋白I（cTnI）具有广泛的检测范围和高稳定性[30]；CdSe/ZnS量子点实现了Cu2+离子的高灵敏度检测[31]；而基于GOQDs的微流控传感平台则实现了多种癌症生物标志物的超灵敏度和高通量检测[32]。此外，用量子点标记的适配体功能化的氧化石墨烯传感器还实现了花生过敏原Ara h1的快速检测[33]。尽管各种纳米材料具有广阔的应用前景，但开发能够协同实现定向抗体固定、最小化非特异性吸附和优异长期稳定性的传感基底仍然是一个挑战。在这方面，CGQDs凭借其出色的光电性质、生物相容性和丰富的羧基团，为共价生物功能化提供了可行的解决方案。
本文介绍了一种基于CGQDs的免疫传感平台。CGQDs通过EDC/NHS策略共价固定在氨基化基底上。使用FTIR、UV–Vis、PL、SERS、HRTEM和XPS对活化前后CGQDs的表面性质和微观结构进行了系统表征。通过AFM和WCA测量比较了PLLSA、GOQDs和CGQDs/EDC/NHS三种基底的表面形态和润湿性。使用微阵列成像评估了CGQD/EDC/NHS（0.125、0.5和1?mg/mL）、GOQDs和PLLSA基底的抗体固定性能。进一步通过间接ELISA（SCP和卵白蛋白（OVA）和夹心ELISA（TM）验证了CGQDs/EDC/NHS基底的可行性。储存97天后，基底没有显著信号衰减，证明了其优异的长期稳定性。从基础材料表征和界面物理化学性质到免疫传感验证，我们的研究展示了基于CGQDs的微流控基底作为稳定、可靠和高性能免疫传感平台的巨大潜力。这项工作为CGQDs的共价固定提供了全面见解，并提供了一种新型材料平台，具有优异的抗体/蛋白质固定能力、良好的批次内和批次间重复性以及长期稳定性，为未来高通量和高可靠性免疫测定的发展奠定了基础。
化学物质和材料
实验中使用玻璃载玻片（ASONE，1–3345-01）作为基底。表面功能化试剂包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，Aladdin）、10?×?聚赖氨酸（Coolaber）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，MedChemExpress）和N-羟基硫辛酰亚胺钠盐（NHS，Macklin）。蛋白质和生化试剂包括牛血清白蛋白（BSA，Hob Biotech Group）、卵白蛋白（OVA，9006-59-1，Macklin），以及2- morpholinoethanesulphonic酸（MES）等。
EDC/NHS活化对CGQDs表面性质和微观结构的影响
CGQDs是通过修饰石墨烯片层的边缘和表面引入羧基团而制备的纳米材料。为了提高其反应性，采用了EDC/NHS活化工艺。在此过程中，EDC首先与羧基反应生成不稳定的O-酰基异脲中间体，随后NHS通过亲核攻击将其转化为稳定的琥珀酰亚胺酯。酯基在温和条件下与伯胺基团结合，形成酰胺共价键，从而实现高度
结论
通过EDC/NHS策略将CGQDs共价固定在硅烷化载玻片上，制备了一种新型微流控免疫传感平台，为生物医学诊断和食品安全监测的应用奠定了坚实基础。该平台在受控条件下的优异抗污染能力和长期稳定性使其在复杂基质中的可靠操作具有巨大潜力，为实际应用奠定了基础。
CRediT作者贡献声明
赵欣：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学、数据整理、概念构思。李永红：资源获取、方法学。黄健：资源获取、方法学。林宏：监督、资源提供。李振星：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家关键研发计划（项目编号：No.2024YFF1105901）和山东省泰山学者基金会（项目编号：NO. tstp20230613）的支持。
