铁死亡（Ferroptosis）会导致质膜pH值下降，这一现象通过一种靶向质膜的比率荧光纳米传感器得以证实

《Microchemical Journal》：Ferroptosis induces a decline of plasma membrane pH as revealed by a membrane-targeted ratiometric fluorescent nanosensor

本研究构建了基于金纳米簇的比率荧光传感器FITC-MTP-Au NCs，实现了5.59-7.81范围内细胞外pH的精准检测，具有高选择性、低细胞毒性和光稳定性，成功用于活细胞膜外pH动态成像及Ferroptosis诱导的膜微环境酸化研究。

　　

林俊华|王静|池熙英|陈沧豪|卓金辉|胡峰|傅发源

福建省医科大学联合医院心血管内科，福建省心血管医疗中心，福建省冠状动脉疾病研究所，福建省心血管研究中心，福州350001，中国

摘要

精确且动态地监测细胞外pH值是解析细胞生理稳态和病理过程的关键且具有挑战性的任务。在这里，我们构建了一种比率型纳米传感器FITC-MTP-Au NCs，通过合成含有膜靶向肽（MTP）及其FITC缀合衍生物（FITC-MTP）作为稳定剂的金纳米簇（Au NCs）来实现对细胞外pH值的准确检测。在该纳米传感器中，Au NCs产生的不敏感于pH值的红光发射（λ_em = 679 nm）作为内部参考信号，而FITC产生的敏感于pH值的绿光发射（λ_em = 521 nm）作为响应信号。这两种发射的差异响应使得在488 nm单波长激发下能够准确且自校准地量化5.59至7.81范围内的pH值。进一步的研究表明，所开发的纳米传感器表现出良好的选择性、优异的可逆性、低细胞毒性和很高的光稳定性。这种纳米传感器成功实现了对活细胞质膜上细胞外pH波动的比率成像。更重要的是，利用这种纳米传感器，我们发现erastin诱导的铁死亡会引发质膜微环境的酸化。这项工作不仅提供了一种研究膜相关过程的强大工具，还为设计特定细胞器的比率型纳米传感器提供了多种策略。

引言

细胞质膜作为分隔细胞内部与其外部环境的关键界面，不仅是一个厚度约为5–8 nm的物理屏障，还是调节多种生理和病理过程的动态平台[1]、[2]、[3]。质膜附近的局部微环境，特别是细胞外pH值（pHe），在信号转导、离子转运和内吞作用等细胞活动中起着关键作用[4]。此外，异常的pHe与多种疾病密切相关，包括感染、炎症、缺血性中风和癌症[5]。具体来说，与正常细胞的中性pHe（7.2–7.4）不同，肿瘤细胞的pHe通常呈酸性，pH值为6.2–6.9，这会影响肿瘤的粘附性、迁移性和药物抗性[6]、[7]。因此，开发用于空间分辨监测pHe动态的可靠工具，尤其是在质膜上，对于深入理解相关生物过程、疾病机制和治疗剂研究具有重要意义。

荧光成像技术凭借其高灵敏度、无创性和实时性优势，已成为分析和可视化活细胞中生物分子和生理参数不可或缺的工具[8]、[9]、[10]。单发射荧光探针容易受到多种因素的干扰，包括探针浓度、仪器因素和环境条件，这可能会影响定量准确性[11]。相比之下，比率型荧光探针通过测量两个不同发射带的比率来自我校准，有效规避了这些限制，实现了更精确和可靠的检测[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。尽管已经开发出使用基因编码荧光蛋白的比率型pH系统并证明了其有效性，但其实际应用仍然具有挑战性。这主要是由于需要转染步骤，这往往会导致样本不均匀，并带来潜在的细胞毒性风险[17]、[18]、[19]。也有基于分子染料探针的比率型pH传感器的研究报道；然而，对有机溶剂的依赖性引发了关于其生物适用性的担忧[20]、[21]。文献中还描述了一种用于细胞外pH检测的比率型i-基序传感器，该传感器通过单链DNA的pH依赖性结构切换来响应pH变化[5]、[7]。考虑到DNA会被血清核酸酶迅速降解，这种探针的体内稳定性需要仔细评估。因此，设计具有低细胞毒性和良好稳定性的新型比率型pH传感器对于细胞外pH测量是非常必要的。

由数百个原子组成的金纳米簇（Au NCs）由于具有优异的光稳定性、较大的斯托克斯位移和低毒性，在生物传感和生物成像领域受到了广泛关注[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。在这项工作中，我们最初设计了一种含有棕榈酸（Pal）的肽（CCYRRRRK-Pal，记为MTP），用于制备具有内在质膜靶向能力的近红外荧光Au NCs（MTP-Au NCs）。MTP整合了四个功能段：一个CCY三肽用于指导Au NCs的合成[28]、[29]，一个阳离子RRRRR四肽用于与带负电的膜进行静电相互作用[30]，一个亲脂性Pal用于插入脂质双层[31]、[32]，以及一个赖氨酸残基（K）作为RRRRR和Pal的连接剂。这种协同设计确保了MTP-Au NCs能够特异性地附着在质膜上，并具有不敏感于pH值的荧光。基于上述结果，我们进一步开发了一种比率型纳米传感器（FITC-MTP-Au NCs），通过合成含有MTP及其FITC缀合衍生物（FITC-MTP）作为稳定剂的Au NCs来实现pH测量。在该纳米传感器中，Au NCs产生的不敏感于pH值的红光发射（中心波长679 nm）作为内部参考信号，而FITC产生的敏感于pH值的绿光发射（峰值波长521 nm）作为响应信号（图1）。这两种发射的不同响应使得在488 nm单波长激发下能够定量检测5.59至7.81范围内的pH值。进一步的研究表明，所开发的纳米传感器表现出高选择性、优异的可逆性、低细胞毒性和很高的光稳定性。作为概念验证，这种纳米传感器成功实现了对活细胞质膜上细胞外pH波动的比率成像。更重要的是，利用这种纳米传感器，我们发现erastin诱导的铁死亡会引发质膜微环境的酸化。

材料

材料

含有Pal修饰的八肽（CCYRRRRK-Pal）和同时含有Pal和FITC修饰的九肽（CCYRRRRK(FITC)K(Pal)）从China Peptides Co., Ltd.购买。金属氯化物盐，即NaCl、KCl、AlCl₃、CaCl₂、FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O、MgCl₂·6H₂O、ZnCl₂、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O和CdCl₂·2.5H₃从Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.购买。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和三水合三氯化金（HAuCl₄·3H₂O）也从相应公司购买。

MTP-Au NCs的制备、表征和应用

为了制备能够选择性标记细胞膜的荧光Au NCs，我们合理设计了一种含有Pal修饰的八肽（CCYRRRRK-Pal，记为MTP），其化学结构如图S1A所示。该MTP包含四个不同的功能段。第一个段CCY是一个在三肽，已被广泛用于荧光金属纳米簇的制备[34]、[35]、[36]。它在此领域的广泛应用使其成为可靠的成分。

结论

总之，本研究构建了一种比率型纳米传感器FITC-MTP-Au NCs，能够准确量化细胞外pH值，具有优异的选择性、良好的可逆性和低细胞毒性。借助这种纳米传感器，我们发现erastin诱导的铁死亡会引发质膜微环境的酸化。这项工作不仅提供了一种研究膜相关生物过程的强大工具，还为设计其他比率型纳米传感器提供了多种策略。

CRediT作者贡献声明

林俊华：撰写 – 原始草稿、方法学、研究、概念构思。王静：撰写 – 原始草稿、方法学、研究、概念构思。池熙英：研究、数据分析、数据管理。陈沧豪：可视化、研究。卓金辉：可视化、研究。胡峰：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。傅发源：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金支持

资助

本研究得到了福建省科学技术厅的指导项目（项目编号2020Y0033）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。