《Molecular & Cellular Proteomics》：Single Cell Proteomics Reveals Novel Cell Phenotypes in Marfan Mouse Aneurysm
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本研究旨在探究马凡氏综合征(MFS)主动脉瘤的细胞异质性。研究人员运用无标记直接单细胞质谱(SCP-MS)技术，解析了小鼠主动脉的单个细胞蛋白质组，成功鉴定了包括7种平滑肌细胞(SMC)亚型在内的主要细胞类型，并揭示了基因型和性别导致的细胞比例与蛋白表达差异。研究不仅验证了SCP-MS在解析复杂组织方面的强大能力，还发现了与疾病相关的新的内皮-间质转化(EndMT)现象及SMC标志物(如Prss2, Lrp1)，为深入理解动脉瘤病理机制和开发新疗法提供了宝贵线索。
在生命科学领域，理解复杂组织的细微构成如同解读一部用不同语言写成的“细胞城市地图”。单细胞RNA测序技术曾带来革命，让我们能够“倾听”每个细胞的“基因低语”。然而，一个根本性难题在于，RNA的“低语”并不总是等同于蛋白质的“行动”，二者之间的对应关系因复杂的生物调控而充满变数。为了直接观察细胞的“功能执行者”——蛋白质，科学家们一直在努力发展单细胞蛋白质组学技术。与此同时，马凡氏综合征作为一种由Fibrillin 1 (Fbn1)基因突变引起的遗传性疾病，其最致命的并发症是主动脉根部动脉瘤。尽管致病基因已知，但针对动脉瘤进展的有效药物治疗仍然匮乏，高风险的主动脉手术是主要治疗手段。这背后，是对于Fbn1突变如何在体内驱动不同细胞类型表型改变，从而引发动脉瘤的分子机制知之甚少。传统研究方法难以精确解析在复杂组织中，特定细胞类型如何响应突变的细胞外基质。为了填补这一知识空白，更深入地揭示主动脉瘤的细胞生物学基础，并为开发新疗法寻找潜在靶点，一项结合前沿单细胞蛋白质组学技术与经典疾病模型的研究应运而生。这项研究论文发表在《Molecular & Cellular Proteomics》上。
为了开展研究，研究人员采用了几个关键技术方法。他们以Fbn1C1041G/+马凡氏综合征小鼠和野生型小鼠的主动脉根部为样本来源，分离获取单个细胞。核心分析技术是基于Bruker TIMSTOF SCP质谱仪的无标记直接单细胞蛋白质组学分析，配合nanoDTSC（纳米双阱单柱）液相色谱方法进行高通量数据采集。在数据分析方面，使用了基于Python的Scanpy包进行生物信息学分析，包括主成分分析、Leiden聚类和UMAP降维可视化。为了验证和拓展发现，研究还整合分析了已发表的单细胞RNA测序数据集，并利用基于Lunaphore COMET仪器的多重循环免疫荧光技术进行了空间蛋白质组学验证。
研究结果
单细胞蛋白质定量和小鼠主动脉细胞质量控制结果
研究人员从12只小鼠（每组基因型-性别组合3只生物学重复）的主动脉中分析了总计3,475个细胞，平均每个细胞检测到约487个蛋白质。经过严格的质控、标准化和批次校正后，获得了可用于下游可靠分析的蛋白质组数据矩阵。
SCP-MS鉴定出主要的主动脉细胞亚型
通过Leiden聚类，所有细胞被分为16个组。通过分析经典细胞标志物的表达模式，成功鉴定出了所有已知的主要主动脉细胞类型，包括平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、间皮细胞和脂肪细胞。UMAP可视化显示，具有相似标志物的细胞类型在二维空间中聚集在一起。
独特的蛋白质组特征定义了平滑肌细胞亚型
平滑肌细胞是主动脉中最主要的细胞类型，占总细胞的58.4%。聚类分析进一步将其细分为7个不同的亚型。这些亚型显示出不同的蛋白质表达谱，可以根据经典收缩标志物（如Myh11, Smtn, Tagln）的表达水平，大致分为“收缩型”和“修饰型”。研究首次在“修饰型”SMC中发现了新的潜在标志物，如低密度脂蛋白受体相关蛋白(Lrp1)和丝氨酸蛋白酶2(Prss2)。
性别和基因型改变细胞类型的丰度
比较分析发现，细胞类型的比例受到性别和基因型的影响。例如，与雌性小鼠相比，雄性小鼠的内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞比例更高。在基因型方面，雄性马凡氏小鼠的“收缩型”SMC3亚型比例显著低于野生型，而“修饰型”SMC7和间皮细胞比例有升高趋势。
Leiden指定细胞类型内因性别和基因型产生的差异蛋白质表达
在单个细胞类型内部进行差异表达蛋白质分析发现，成纤维细胞中存在最多的性别差异表达蛋白。更重要的是，在马凡氏小鼠的内皮细胞中，发现了一系列蛋白质表达变化模式，提示存在内皮-间质转化过程，即内皮细胞标志物（如Pecam1）下调，而间质细胞标志物（如Cnn1, Myh11）上调，这种变化在雄性小鼠中尤为明显。
使用空间蛋白质组学验证单细胞比例、选定标志物和EndMT表型
通过空间蛋白质组学技术，研究人员在独立的组织切片上验证了SCP-MS的关键发现。他们证实了Prss2和Lrp1在主动脉中膜层平滑肌细胞中的共表达，并且马凡氏小鼠组织中Prss2高表达的平滑肌细胞比例更高。同时，空间成像也直接观察并证实了马凡氏小鼠主动脉内皮细胞中EndMT标志物（Zeb1, Smad2）的表达增加。
比较马凡小鼠的单细胞RNA和蛋白质揭示了细胞类型分配的关键差异
将本研究SCP-MS数据与已发表的同类小鼠单细胞RNA测序数据进行比较和整合分析发现，两种模态在鉴定主要细胞类型（如SMC、内皮细胞）上具有一致性，但在区分更精细的细胞亚型（特别是SMC亚型）时，蛋白质和RNA数据给出的分类信息重合度很低，调整兰德指数极低，表明基于转录组和蛋白质组对细胞亚型的定义存在显著差异。
SMC的多组学分析揭示了马凡小鼠中富集的独特基因特征
专门针对平滑肌细胞进行多组学整合分析，产生了7个新的多组学定义的SMC聚类。其中，聚类1和聚类4在马凡氏小鼠中比例显著升高。聚类4的特征标志物是血管紧张素转换酶(Ace)和原肌球蛋白4(Tpm4)，聚类1的标志物包括S100a4。通路分析显示，野生型富集的聚类富含平滑肌收缩相关特征，而马凡氏富集的聚类则与细胞骨架组织、细胞外基质-受体相互作用和吞噬体通路相关。
使用空间蛋白质组学验证多组学表型标志物
空间蛋白质组学验证证实，约20%的平滑肌细胞为Ace高/Tpm4高表型，且该表型在马凡氏小鼠中比例更高，这与多组学分析的发现一致。然而，单纯S100a4高的平滑肌细胞在空间数据中非常罕见，提示多组学定义的聚类1和4在蛋白质水平上可能并非截然不同的亚型。
研究结论与意义
这项研究是早期将单细胞质谱蛋白质组学应用于复杂哺乳动物组织的一次成功实践。它证实了即使在使用早期一代仪器、蛋白质检测深度相对有限的情况下，SCP-MS仍能精准解析小鼠主动脉这样的异质性组织，识别所有主要细胞类型及其亚型，并揭示由疾病和性别驱动的细胞组成与蛋白质表达变化。
研究产生了若干新颖的生物学发现，为理解马凡氏综合征动脉瘤的发病机制提供了新视角。首先，在蛋白质组水平发现了平滑肌细胞“修饰型”状态的新标志物Prss2和Lrp1，其表达在马凡氏小鼠中上调，二者在肿瘤中的相互作用已知，但在动脉瘤中的作用首次被提示，构成了新的研究假说。其次，通过差异蛋白分析和空间验证，提供了马凡氏综合征主动脉中存在内皮-间质转化现象的证据，将EndMT与MFS动脉瘤病理更紧密地联系起来。此外，多组学整合分析鉴定出的、在马凡氏小鼠中富集的平滑肌细胞亚型（以Ace和Tpm4为标志），将已知与动脉粥样硬化等血管病变相关的分子与MFS发病机制联系起来，提示了新的潜在干预靶点。
本研究另一个重要贡献在于直接比较和整合了单细胞蛋白质组与转录组数据。结果突出表明，尽管两种技术在界定主要细胞类型上一致，但在描述细胞亚型异质性，特别是平滑肌细胞亚型时，得出的结论可能大相径庭。这提示，仅凭转录组或蛋白质组单一模态的数据来推断细胞表型可能是不完整的，两者的整合能提供更全面、互补的生物学见解。随着从同一细胞中同时提取RNA和蛋白质的双组学技术的发展，本研究强调了将该技术应用于复杂组织的重要性。
总之，这项研究不仅展示了SCP-MS技术在探索复杂生物系统方面的巨大潜力，而且通过发现新的细胞表型和分子标志物（如EndMT、Prss2、Lrp1、Ace、Tpm4），为深入阐明马凡氏综合征主动脉瘤的细胞分子机制开辟了新道路，为未来开发针对特定细胞表型的疗法奠定了理论基础。
