《Journal of Extracellular Biology》：Proteomic Epithelial-To-Mesenchymal Transition Signature in Fetoplacental Small Extracellular Vesicles of Early-Onset Preeclampsia
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本研究首次系统解析了早发型子痫前期（EO-PE）胎盘中内皮细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）的蛋白质组学特征，发现其富含上皮-间质转化（EMT）和肌生成相关蛋白，提示这些囊泡可能通过传递组织重塑和血管稳态失调信号，参与胎儿宫内发育异常及远期健康风险。该工作为理解子痫前期的胎盘-胎儿通讯机制提供了新视角。
文章内容归纳总结
1 引言
子痫前期（Preeclampsia, PE）是一种全球范围内影响约5%-8%孕妇的严重多系统妊娠疾病，以妊娠20周后出现高血压和终末器官功能障碍为特征。从临床角度，PE被分为早发型（EO-PE，妊娠34周前发病）和晚发型（LO-PE）。EO-PE临床表现更严重，母婴结局更差，常由胎盘形成异常和灌注受损导致，进而引发胎盘缺氧和炎症。这些胎盘异常不仅导致母体全身内皮功能障碍，还危及胎儿健康，增加胎儿生长受限、早产（PT）及围产期发病率和死亡率的风险。此外，宫内暴露于PE还可能使子代易患长期健康问题，包括神经发育受损、心血管并发症和免疫功能障碍，但其机制尚不清楚。
胎盘是连接母体和胎儿血液循环的关键胎儿器官，负责营养、气体和废物交换，并调节母体免疫耐受和血管稳态。近年来，细胞外囊泡（EVs），特别是小细胞外囊泡（sEVs），被认为是母胎界面细胞间通讯的关键介质。胎盘EVs携带着复杂的生物活性物质，包括蛋白质、脂质和核酸，反映了胎盘的生理和病理状态，并能影响局部和全身受体细胞的功能。
胎盘在结构上包含母体和胎儿两侧的细胞屏障：朝向母体血液的是合体滋养层，而胎儿血管则由胎盘内皮细胞（fpECs）衬覆。迄今为止，大多数研究都集中在滋养层来源的EVs上，而对胎盘胎儿面来源的EVs，特别是fpECs来源的EVs知之甚少。考虑到几乎所有有活力的细胞都会释放EVs，fpECs也极有可能向胎儿循环中分泌EVs。特别是在病理妊娠（如EO-PE）的背景下，fpECs来源的EVs的分子组成和信号传递潜力，可能指向其在胎儿血管发育、代谢调节和免疫启动中的作用，但这一领域仍未得到充分探索。
本研究从临床特征明确的足月（T）、早产（PT）和EO-PE妊娠中分离了原代fpECs，并从中分离了sEVs。通过蛋白质组学分析，我们比较了这些sEVs的组成，旨在识别与EO-PE相关的病理生理学改变。本研究为理解胎盘来源sEVs的分子多样性、其在介导胎盘-胎儿通讯中的作用及其对胎儿宫内发育的潜在贡献提供了新见解。
2 材料与方法
研究样本采集自奥地利格拉茨医科大学妇产科。队列和样本处理均获得伦理委员会批准，并获得了所有参与者的知情同意。对照组根据分娩时间点采样：妊娠≥38周分娩的为足月对照组，妊娠<37周分娩的为早产对照组。EO-PE的诊断依据美国妇产科医师学会指南。研究人群的详细特征已在文中表格列出。
原代fpECs的分离和培养采用已发表的方法。从胎盘绒毛板动脉中分离细胞，并在特定内皮细胞生长培养基中培养。细胞纯度通过流式细胞术确认。
sEVs的分离采用改良的差异超速离心方案。收集条件培养基，通过一系列离心步骤去除细胞、细胞碎片、凋亡小体和大EVs，然后通过0.22 μm过滤器过滤，并使用蛋白浓缩仪浓缩，最后经超速离心获得sEVs沉淀。所得sEVs重悬于PBS或RIPA缓冲液中备用。
sEVs的表征采用了多种技术：透射电子显微镜用于观察形态；纳米颗粒跟踪分析用于测定颗粒大小和浓度；蛋白质印迹法用于检测经典的EV标志物、内皮标志物以及非囊泡污染标志物。
对sEVs进行了纳米液相色谱-串联质谱蛋白质组学分析。蛋白质经酶解、脱盐后上机检测。原始数据使用MaxQuant软件处理，搜索人类SwissProt数据库。数据分析使用Perseus软件，进行了缺失值插补、差异丰度分析和基因集富集分析。
3 结果
3.1 来自fpEC的sEVs的表征
研究首先按照MISEV2023指南，对来自T、PT和EO-PE妊娠fpECs的sEVs进行了全面表征。TEM图像显示所有三组中均存在sEVs，呈现典型的圆形膜包被形态，大小在50-150 nm之间。定量分析显示，T-sEVs平均直径为65.6 nm，PT-sEVs为66.8 nm，EO-PE-sEVs为44.6 nm。NTA测定的平均颗粒大小在103-112 nm之间，模式大小约为78-83 nm。颗粒浓度分析显示，PT组每个细胞释放的颗粒数量显著高于T组。蛋白质印迹分析证实了所有组sEVs中均存在经典的EV标志物、内皮标志物，且不含载脂蛋白B污染，支持了sEVs分离物的高纯度。
3.2 T-、PT-和EO-PE来源sEVs的蛋白质组学分析和差异丰度分析
蛋白质组学分析在全部三组中共鉴定到1329个独特蛋白质。PT-sEVs检测到的蛋白质数量最多，其次是T-sEVs和EO-PE-sEVs。有877个蛋白质在所有三组中共有，构成核心sEV蛋白质组。主成分分析显示，T和PT样本聚集紧密，而EO-PE样本离散度更大，表明其异质性更高。PT和EO-PE组形成了明显不同的、不重叠的簇，表明蛋白质组存在显著差异。
差异蛋白质丰度分析发现了一些具有组间差异的蛋白质。例如，在T与PT比较中，RANBP1在T-sEVs中更丰富，而ACP1在PT-sEVs中更丰富。在EO-PE与T比较中，CCDC22和HAPLN3在T-sEVs中更丰富，而DPYS在EO-PE-sEVs中更丰富。在EO-PE与PT比较中，ATP6V1C1在PT-sEVs中更丰富，而GYS1在EO-PE-sEVs中更丰富。
3.3 EO-PE-sEVs富含上皮-间质转化蛋白质
为了探究sEV蛋白质组的功能意义，研究对全部检测到的蛋白质进行了无监督的基因集富集分析。分析发现，在EO-PE来源的sEVs中，与上皮-间质转化和肌生成相关的基因集被显著富集。驱动EMT特征的核心富集蛋白包括多种胶原蛋白、细胞外基质重塑蛋白以及胰岛素样生长因子结合蛋白2等。与肌生成相关的蛋白，如层粘连蛋白和肌球蛋白，也在EO-PE-sEVs中富集。此外，EO-PE-sEVs还在顶端连接和凝血相关通路中富集。这些发现表明，EO-PE-sEVs携带了反映细胞外基质重塑和血管稳态失调的独特蛋白质组特征，与PE的病理生理学一致。
相比之下，T-sEVs在与细胞周期调控和基因组稳定性相关的通路上富集，特别是G2/M检查点、E2F靶标和DNA修复通路。虽然PT-sEVs的整体蛋白质组特征与T-sEVs非常相似，但与EO-PE-sEVs相比，PT-sEVs在氧化磷酸化通路上有选择性富集。
3.3.1 EO-PE-sEVs对靶细胞的独特作用
为了验证EO-PE-sEVs中EMT和ECM相关蛋白质特征是否与内皮细胞反应相关，研究使用人脐静脉内皮细胞作为靶细胞模型，用T-、PT-和EO-PE-fpECs来源的sEVs处理48小时。RT-qPCR分析显示，与未处理对照相比，用PT-和EO-PE来源的sEVs处理后的HUVECs中，血管内皮钙粘蛋白的表达显著下调，表明内皮连接相关基因表达发生了改变。间质和EMT相关基因的表达在各处理组间基本无变化。用T-sEVs处理的HUVECs中血管性血友病因子表达增加。形态学观察显示，T-sEVs处理的细胞密度更高、更均匀；而PT-和EO-PE-sEVs处理的细胞保持了铺路石样形态，但表现出密度异质性增加和少量细胞伸长，提示单层结构有轻微破坏。这些早期迹象揭示了PT-和EO-PE来源的sEVs诱导的内皮细胞形态和单层组织的微妙改变。
4 讨论
本研究首次在控制胎龄影响的情况下，表征了来自足月、早产和早发型子痫前期妊娠的fpECs来源的sEVs。蛋白质组学分析显示，EO-PE来源的sEVs在EMT和肌生成标志通路上特异性富集，而T-sEVs则在细胞周期控制和DNA修复机制相关的蛋白质上富集。这些发现表明，当释放到细胞外空间时，胎盘sEVs具有独特的货物组成和蛋白质装载能力，可能作为反映其来源组织病理生理状态的信号实体。
研究发现了PT-和EO-PE-fpECs与T-fpECs相比，每个细胞处理的sEVs数量存在差异，这表明亲本细胞的代谢状况影响了释放sEVs的数量和组成。蛋白质组学分析显示，三组间有66%的蛋白质共享，支持了fpECs来源sEVs中存在保守的囊泡蛋白质组。然而，当考虑定量丰度水平时，EO-PE来源的sEVs表现出更大的蛋白质异质性和更明显的功能差异。这种异质性可能反映了EO-PE内皮细胞真实的生物学多样性。
GSEA分析揭示了EO-PE来源sEVs货物中存在EMT样蛋白质组特征。鉴于这些囊泡的内皮来源以及EMT与内皮-间质转化的相似性，我们的发现提示了EO-PE来源sEVs中存在血管重塑特征。先前的研究报告了PE相关的胎儿血管适应不良，如脐带管腔尺寸减小、血管壁增厚和肌化增加。PE脐带血中内皮祖细胞减少，以及PE来源的HUVECs成管能力和迁移能力减弱，进一步提示了PE中的血管功能障碍。PE来源的EVs可诱导HUVECs内皮功能障碍，为PE来源的囊泡货物可能在体外调节内皮反应提供了证据。我们的数据表明，富含基质重塑和血管适应相关蛋白的fpECs来源sEVs，可能有助于胎儿内皮活化和血管信号改变。
除了PE中观察到的急性血管变化，这些改变还可能影响子代的长期健康。流行病学研究一致报告，PE出生的儿童血压更高、动脉僵硬度增加，并有早期血管老化迹象。在EO-PE sEVs中观察到的EMT和肌生成富集蛋白质组特征，可能代表了导致这些长期心血管风险的早期分子变化。
为了确定EO-PE来源sEVs中EMT和ECM相关蛋白质组特征的功能作用，我们使用原代HUVECs作为靶细胞模型。暴露于EO-PE来源sEVs主要导致CDH5表达下调，这是内皮连接不稳定的关键组成部分，表明内皮激活和早期重塑。形态学上，HUVECs保持了汇合的铺路石样单层，仅在EO-PE-和PT-sEVs处理的HUVECs中有轻微的细胞伸长。这支持了早期内皮反应，而非EMT驱动的表型。重要的是，虽然EO-PE-sEVs富含与间质细胞转化相关的EMT和ECM相关蛋白，但在分析的细胞培养中，相关的内皮激活并未进展到早期阶段之后。
T来源的sEVs主要在与细胞周期控制和DNA修复相关的蛋白质上富集，这反映了PE中细胞增殖受损和DNA损伤反应的报道。在母体系统中，PE来源的胎盘EVs中DNA修复能力丧失和氧化应激也有报道。我们假设，在PE中具有富集EMT货物的fpECs来源sEVs，有助于胎盘单位和胎儿的血管适应不良。
本研究的一个主要优势是使用了来自临床特征明确的T、PT和EO-PE妊娠的原代人fpECs。包括PT-fpECs特别有价值，因为它区分了胎龄依赖性效应和EO-PE特有的EV蛋白质组效应。我们的蛋白质组学分析首次提供了证据，表明EO-PE改变了分泌到胎儿腔室的胎盘sEVs的蛋白质货物。一个关键限制是样本量小，特别是EO-PE组，这反映了早发型PE的罕见性。此外，本研究侧重于蛋白质组学分析，未涵盖其他生物活性EV成分。尽管我们的HUVECs体外数据表明了对fpECs来源sEVs的早期内皮反应，但需要进一步研究来确定这些早期反应是否会在体外和体内转化为对胎儿靶细胞的功能性后果。
5 结论
本研究首次全面表征了来自足月、早产和早发型子痫前期妊娠的原代fpECs分泌的sEVs。总体而言，蛋白质组货物在很大程度上是保守的，但EO-PE来源的sEVs在与内皮激活和细胞骨架重组相关的蛋白质上特异性富集，这些都与早期EMT中观察到的机制有关。T来源的sEVs在细胞周期依赖性蛋白质上富集，这表明它们比PT-和EO-PE来源的sEVs更能支持增殖过程。尽管PE的研究重点主要在母体循环，但我们对原代fpECs和蛋白质组学分析的使用表明，胎盘EVs在胎盘-胎儿通讯中具有潜在作用，这与胎儿发育相关。未来需要对sEVs的货物及其对靶细胞的功能验证进行更多研究，以阐明它们在PE妊娠后代代谢改变中的作用及其对长期健康的影响。
