《Non-coding RNA Research》：Diagnostic potential of circular RNAs in carotid atherosclerotic plaque vulnerability
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颈动脉易损斑块是卒中的重要风险源，但其术前无创评估仍是临床难点。本文研究了外周血单个核细胞（PBMCs）中循环环状RNA（circRNAs）作为术前识别斑块易损性生物标志物的潜力，发现CDR1as等circRNAs表达与斑块易损性及局部炎症显著相关，为开发非侵入性风险分层工具提供了新思路。
想象一下，人体内的血管如同纵横交错的城市供水管道。年深日久，管道内壁会沉积水垢，形成“斑块”。对于颈动脉（为大脑供血的主要血管）而言，最危险的并非斑块本身，而是那些表面不完整、内部炎症活跃、如同“不定时炸弹”般随时可能破裂的“易损斑块”。一旦破裂，形成的血栓会随血流堵塞脑血管，引发中风（卒中）。中风是全球第二大死亡原因，给个人和社会带来沉重负担。目前，医生判断一个颈动脉斑块是否“易损”，最确切的方法是在手术切除后，在显微镜下观察其组织结构。然而，这毕竟是“事后诸葛亮”，无法在术前为患者提供精准的风险预警。虽然CT、MRI等影像学检查有所帮助，但存在成本高、辐射暴露、解读依赖专家等局限。因此，临床亟需一种像抽血化验一样简便、可靠的方法，在手术前就能从血液中找到能反映斑块“内在不稳”状态的分子信号。这就是开展本研究的核心驱动力。
近年来，科学家们发现，除了能编码蛋白质的信使RNA（mRNA）外，细胞中还存在着大量不编码蛋白质的非编码RNA（ncRNA），它们在生命活动中扮演着精细的“调控者”角色。环状RNA（circular RNA， circRNA）是其中一类特殊成员，因其首尾相接形成闭环结构，比线性RNA更稳定，且能在血液等体液中稳定存在，成为极具潜力的疾病生物标志物“新星”。已有研究提示某些circRNAs与心血管疾病相关，但它们能否作为颈动脉斑块易损性的“血液警报器”，此前研究甚少。为此，由Simona Greco、Federica Perego等研究者组成的团队，在《Non-coding RNA Research》期刊上发表了一项探索性研究，旨在回答：从患者外周血中分离的免疫细胞（外周血单个核细胞， PBMCs）里，特定的circRNAs水平能否帮助我们区分颈动脉易损斑块和稳定斑块？这些分子信号又与斑块内部的炎症状态有何关联？
为了回答这些问题，研究人员开展了一项严谨的临床-基础结合研究。他们招募了在2019年7月至2023年3月期间，因颈动脉严重狭窄而计划接受颈动脉内膜切除术的患者。根据既定标准，斑块在手术中被外科医生和病理学家现场宏观及显微镜下评估，并明确分类为“易损”或“稳定”。研究的关键在于同步采集和分析两种样本：一是手术切除的斑块组织本身，用于分析其内部的分子特征；二是在手术前从患者静脉血中分离出的PBMCs，用于寻找潜在的循环生物标志物。研究人员运用了多种分子生物学关键技术：首先，使用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）这一金标准技术，精准定量了PBMCs和斑块组织中一系列目标分子的表达水平。在PBMCs中，他们重点检测了四个基于文献筛选的、与内皮功能和动脉粥样硬化相关的候选circRNAs（包括circVIRMA、circGRN、circANRIL和CDR1as）及其对应的线性宿主基因mRNA。在斑块组织中，他们则检测了一系列炎症相关因子（如IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, CCL5, PPARγ）的mRNA水平。其次，为了整合多个circRNAs的信息并提升判别力，他们构建了复合评分，如circRNA_SCORE（差异表达circRNAs的平均表达水平）和circ/linear mRNA_SCORE（circRNA与对应线性mRNA表达比值的平均值）。再者，利用生物信息学方法，他们通过ENCORI、mirDIP等数据库，预测了由这些差异circRNAs、它们可能结合的微小RNA（miRNA）以及下游靶基因mRNA构成的竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络，并对网络涉及的生物学通路进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最后，所有数据的统计分析，包括组间比较、相关性分析、逻辑回归以及诊断效能评估（通过受试者工作特征曲线，即ROC曲线分析），均遵循了严格的统计学规范。
研究结果层层递进，揭示了 circRNAs 作为生物标志物的潜力及其与斑块生物学特性的关联：
3.1. circRNA deregulation in PBMCs of carotid stenosis patients（颈动脉狭窄患者PBMCs中环状RNA的表达失调）
研究人员首先在PBMCs中检测候选circRNAs。他们发现，与稳定斑块患者相比，易损斑块患者的PBMCs中：
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circVIRMA(3-4) 和 circGRN(12-13) 的表达水平有适度但显著的升高，而它们对应的线性宿主基因（VIRMA和GRN）的mRNA水平在两组间无差异。这表明上调是circRNA形式特异的。
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两个circANRIL亚型（circANRIL(5-7)和circANRIL(4-14)）及其线性形式在两组间无显著差异。
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最重要的发现来自于 CDR1as(1) （也称为CiRS-7）。在患者子集中，易损斑块患者PBMCs中的CDR1as(1)水平显著高于稳定斑块患者，而其线性对应基因CDR1的mRNA无变化，导致CDR1as(1)/CDR1 mRNA比值在易损组大幅增加。ROC曲线分析显示，CDR1as(1)及其与CDR1的比值在区分易损与稳定斑块方面表现出最强的判别能力，优于其他circRNAs。
3.2. circRNA_SCORE and circ/lin_mRNA_SCORE elevation in PBMCs of patients with vulnerable plaques（易损斑块患者PBMCs中circRNA评分和circ/线性mRNA评分升高）
为了整合信息，研究人员计算了复合评分。将显著失调的circVIRMA(3-4)和CDR1as(1)的表达（或其与线性mRNA的比值）取平均值，得到了circRNA_SCORE和circ/lin mRNA_SCORE。这两个评分在易损斑块患者的PBMCs中均显著更高，并且具有良好的诊断区分能力。不过，它们的表现并未显著优于单独的CDR1as(1)指标。
3.3. Increase of the CDR1as(1)/lin CDR1 mRNA ratio levels in vulnerable plaque tissue（易损斑块组织中CDR1as(1)/线性CDR1 mRNA比值水平升高）
研究人员进一步探究斑块组织内部的情况。由于技术限制，仅在斑块组织中可靠检测到CDR1as(1)。结果发现，在斑块组织内，易损斑块中的线性CDR1 mRNA水平显著低于稳定斑块，而CDR1as(1)水平仅有轻微不显著的下降，这使得CDR1as(1)/CDR1 mRNA比值在易损斑块组织中显著升高。这表明在斑块局部也存在circRNA形式的特异性调节。
3.4. Inflammatory marker characterization of the carotid plaques（颈动脉斑块的炎症标志物特征）
研究证实了易损斑块具有更强的炎症特征。在斑块组织内，促炎细胞因子IL-1β、IL-6，以及抗炎细胞因子IL-10和核受体PPARγ的mRNA水平，在易损斑块中均显著高于稳定斑块。研究人员将IL-1β、IL-6、IL-10和PPARγ的表达值平均，构建了一个名为“斑块内评分”（in-plaque_SCORE）的复合炎症指标，该评分在易损斑块中显著更高。更有意义的是，在一个患者亚组中，来自血液的circRNA_SCORE与来自斑块组织的in-plaque_SCORE呈显著正相关。这直接将外周血中的circRNA系统变化与斑块局部的炎症状态联系了起来。
3.5. Vulnerable plaque ceRNA regulatory network and predicted functional pathways（易损斑块的ceRNA调控网络及预测的功能通路）
通过对三个失调的circRNAs（CDR1as(1)、circVIRMA(3-4)、circGRN(12-13)）进行生物信息学分析，研究人员构建了一个预测的ceRNA调控网络。通路富集分析显示，该网络潜在影响的基因显著富集在多个与血管生物学和动脉粥样硬化密切相关的通路上，包括RAS信号通路、RAP1信号通路和黏着斑（Focal adhesion）通路。这提示这些circRNAs可能通过调控这些关键通路参与动脉粥样硬化的发生发展。
综合以上结果，本研究得出了明确结论：外周血单个核细胞（PBMCs）中的环状RNA（circRNAs），尤其是CDR1as(1)，显示出作为颈动脉斑块易损性无创生物标志物的巨大潜力。此外，circVIRMA(3-4)和circGRN(12-13)也具有一定的指示意义。其中，CDR1as(1)无论是单独使用还是以其与线性CDR1的比值形式，都表现出最强的诊断区分能力。这些circRNAs的表达变化并非孤立事件，它们与斑块组织内部的炎症活性评分（in-plaque_SCORE）显著相关，表明其能够系统性地反映斑块局部的病理状态。生物信息学分析进一步提示，这些circRNAs可能通过参与RAS、RAP1等关键信号通路调控网络，在斑块易损性的分子机制中扮演角色。
这项研究的意义重大。它首次较为系统地将PBMCs来源的circRNAs与颈动脉斑块易损性这一临床迫切问题联系起来，为卒中风险的无创、术前评估开辟了新的分子视角。尽管研究存在一些局限性，如需要在更大规模的独立队列中验证、ceRNA网络基于预测有待功能实验证实等，但其发现为开发基于血液的、用于识别高危颈动脉疾病患者（包括无症状者）的新型生物标志物面板奠定了重要基础。未来，将这些有潜力的circRNAs标志物与影像学检查相结合，有望实现更精准的个体化风险分层和治疗决策，从而更有效地预防致残致死的卒中发生。
