《Molecular Plant Pathology》：Jujube Witches' Broom Phytoplasma Effectors SJP1/2 Manipulate the ZjTCP2-ZjTCP1 Cascade to Repress Leaf Cell Proliferation in Jujube
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这篇研究深入揭示了枣树（Ziziphus jujuba）的重要病害——枣疯病（Jujube Witches' Broom, JWB）导致小叶症状的分子机理。研究发现，病原植原体分泌的效应蛋白SJP1和SJP2通过稳定CIN-TCP类转录因子ZjTCP2，进而直接抑制CYC/TB1-TCP类转录因子ZjTCP1的表达，最终下调了细胞增殖相关基因（如ZjAN3、ZjANT、ZjCYCB1;1），导致叶片细胞数量减少、叶片变小。该工作为理解木本植物中植原体致病机理提供了新见解。
引言
枣（Ziziphus jujuba）是中国起源的古老果树，具有重要的经济和营养价值。然而，由“Candidatus Phytoplasma ziziphi”引起的枣疯病（JWB）是一种毁灭性病害，导致植株出现小叶、黄化、丛枝、矮化及花变叶（phyllody）等症状，严重损害产业。植原体是一类局限于植物韧皮部筛管的无细胞壁细菌，通过分泌毒性效应蛋白干扰植物发育调控网络。其中，SAP11家族效应蛋白的同源物，如来自JWB植原体的SJP1和SJP2，被证实可诱导丛枝和小叶症状。前期研究表明，SJP1/2通过促进CIN-TCP转录因子ZjTCP2的积累来诱导小叶形成，但抑制叶片细胞增殖的分子机制尚不清楚。TCP转录因子是植物特有的调控发育的关键因子，分为Class I和Class II两大类，其中Class II包含CIN-TCP和CYC/TB1-TCP两个亚家族。成熟的叶片大小由细胞数量和大小决定，即受细胞增殖和扩张的时空调控。理解JWB植原体干扰叶片发育的机制，对开发有效的病害防控策略至关重要。
结果
2.1 ZjTCP2抑制枣树叶细胞增殖
此前研究发现，过表达ZjTCP2的拟南芥叶片变小。为在枣树中验证其功能，研究团队获得了过表达ZjTCP2-mCherry的转基因枣树愈伤组织并诱导出苗。与野生型（WT）相比，转基因株系的成熟叶片面积显著减小（约减少25%），叶片下表皮铺板细胞数量也明显减少（约减少23%），但细胞大小无显著差异。这些结果表明，ZjTCP2通过抑制细胞增殖而非改变细胞大小来减小叶片面积。
2.2 ZjTCP2直接靶向并抑制ZjTCP1
TCP家族转录因子ZjTCP1（CYC/TB1-TCP亚家族成员）可能参与叶片发育调控。研究发现，在ZjTCP2转基因枣树的幼叶中，ZjTCP1的表达显著下调。同样，在SJP1/2转基因枣树以及JWB感染的枣树植株中，ZjTCP1的表达也显著降低，而这些植株中ZjTCP2的表达是上调的。生物信息学分析在ZjTCP1启动子区-1153 bp处发现了一个潜在的TCP结合基序（GGNCCC）。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验证实，ZjTCP2能够直接结合ZjTCP1启动子并抑制其表达。
2.3 ZjTCP1通过促进细胞增殖增加叶片大小
为探究ZjTCP1的功能，研究团队在拟南芥中过表达了ZjTCP1。与表达GFP的对照相比，过表达ZjTCP1的转基因株系表现出明显的大叶表型，其成熟第一莲座叶面积显著增加（增幅达77.6%-89.7%），下表皮铺板细胞数量也显著增多（增幅达55.6%-62.9%），但细胞大小无差异。对第一片叶子生长运动学的分析显示，ZjTCP1叶片从早期（6天）就开始以更快的速率扩展，细胞增殖速率更快，导致成熟叶片中细胞数量约为对照的1.5倍，但细胞增殖停止的时间与对照相似，细胞大小在所有测量阶段均与对照一致。这些结果表明，ZjTCP1在叶片生长早期通过促进细胞增殖发挥积极作用。
2.4 ZjTCP1直接靶向并正向调控细胞增殖基因ZjAN3、ZjANT和ZjCYCB1;1
在健康枣树中，ZjTCP1在侧芽发育和叶片伸出期高表达，在叶片扩展期显著下降，这与细胞增殖活跃期吻合。在ZjTCP1转基因拟南芥的幼叶中，细胞增殖相关基因AN3、ANT和有丝分裂标记基因CYCB1;1被激活。生物信息学分析在枣树同源基因ZjAN3、ZjANT和ZjCYCB1;1的启动子中均发现了TCP结合基序。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验证实，ZjTCP1能直接结合这些基因的启动子并促进其表达。
2.5 ZjTCP2抑制ZjAN3、ZjANT和ZjCYCB1;1的表达
ZjAN3、ZjANT和ZjCYCB1;1在芽发育和叶片伸出期高表达，在叶片扩展期下调，表达模式与ZjTCP1相似。在ZjTCP2转基因枣树中，这三个基因的表达均被显著抑制。这进一步证实了ZjTCP2通过抑制细胞增殖来减小叶片大小。
2.6 效应蛋白SJP1和SJP2通过抑制由ZjTCP1介导的细胞增殖诱导小叶症状
前期研究发现SJP1能与ZjTCP1互作。本研究中，在本氏烟中共表达实验表明，SJP1能导致ZjTCP1蛋白丰度降低。在SJP1/2转基因枣树以及JWB感染的枣树植株中，细胞增殖相关基因ZjAN3、ZjANT和ZjCYCB1;1的表达均显著下调。因此，JWB植原体通过分泌效应蛋白SJP1和SJP2，一方面通过操控ZjTCP2来抑制ZjTCP1的转录，另一方面SJP1还能直接降解ZjTCP1蛋白，从而双重抑制细胞增殖通路，导致小叶症状。
讨论
3.1 ZjTCP1在叶片生长早期调控细胞增殖中起关键作用
本研究首次明确了CYC/TB1-TCP亚家族成员ZjTCP1在叶片发育中的功能。过表达ZjTCP1能通过增加细胞数量（而非细胞大小）来增大叶片面积。生长运动学分析和其在枣树早期叶片发育中的高表达模式，均支持ZjTCP1是叶片早期细胞增殖的正调控因子。其分子机制在于直接结合并激活细胞增殖相关基因ZjAN3、ZjANT和细胞周期蛋白基因ZjCYCB1;1的启动子。这表明ZjTCP1及其同源物在不同物种中调控叶片增殖的机制可能是保守的。
3.2 效应蛋白SJP1/2通过扰乱ZjTCP2-ZjTCP1级联抑制JWB感染枣树的叶细胞增殖
CIN-TCP转录因子如ZjTCP2通常通过促进细胞分化来抑制增殖。本研究发现，ZjTCP2过表达会减少叶片细胞数量，而ZjTCP1过表达则增加细胞数量，两者在调控细胞增殖上存在拮抗作用。分子机制上，ZjTCP2直接靶向并抑制ZjTCP1的表达，进而抑制了ZjTCP1下游的促增殖靶基因。在JWB植原体感染情境下，效应蛋白SJP1/2通过转录和翻译后水平稳定并激活ZjTCP2，增强了对ZjTCP1的抑制；同时，SJP1还能直接降解ZjTCP1蛋白。两者协同作用，强力阻断了由ZjTCP1驱动的细胞增殖通路，最终导致叶片细胞数量减少和小叶表型。
这项研究首次在木本植物中揭示了植原体效应蛋白通过操纵“CIN-TCP抑制CYC/TB1-TCP”这一级联通路来抑制叶片细胞增殖的完整分子机制，不仅深化了对植原体致病机理的理解，也为通过遗传改良（如操控ZjTCP1）培育大叶、高光效枣树品种提供了潜在靶点。
