《Molecular Plant Pathology》：Sugarcane Small Heat Shock Proteins Facilitate Sugarcane Mosaic Virus Replication via Interaction With the Movement Protein P3N-PIPO
编辑推荐：
本研究利用时间分辨转录组学，比较了甘蔗花叶病毒（SCMV）感病品种Badila及其抗病体细胞突变体FG1在不同侵染阶段的响应差异。研究发现，抗性基因型FG1能通过快速、持续的防御相关转录重编程和早期病毒清除来限制SCMV，而感病品种Badila则表现出延迟且以抑制为主的基因表达变化。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出与病毒RNA水平高度相关的模块，并发现小热激蛋白基因ScHSP17.5是感病性的关键枢纽。进一步的蛋白互作和功能实验证实，ScHSP17.5和ScHSP17.9A特异性与SCMV的运动蛋白P3N-PIPO（而非P3或外壳蛋白CP）互作，并在本氏烟中过表达时能协同增强SCMV的RNA复制。本研究揭示了一个模型：SCMV通过P3N-PIPO劫持宿主小热激蛋白以促进病毒积累，而早期的氧化还原和信号相关响应则限制病毒在抗性甘蔗中的侵染。这项工作为理解SCMV-宿主互作提供了机制性见解，并为抗性育种提供了候选靶点。
2 结果
2.1 FG1与Badila的SCMV复制存在显著差异
通过绝对定量方法评估了病毒复制动态。感染后，感病品种Badila叶片表现出花叶症状并具有高病毒载量（约2.45 × 108拷贝/叶单位），而抗性突变体FG1则无症状且检测不到SCMV。时间进程定量显示，接种后6小时（hpi），两个基因型均出现早期复制。但在FG1中，病毒RNA水平在6至48 hpi期间始终低于1 × 105拷贝，并在192 hpi时检测不到。相比之下，Badila在18 hpi时出现一个尖锐的高峰，其病毒RNA水平是FG1同时间点的约2000倍。Badila的病毒RNA水平在48 hpi时下降，随后在192 hpi时再次上升至约4.35 × 105拷贝。基于这些数据，18 hpi被确定为Badila中SCMV RNA复制达到峰值的时间点，用于后续重点分析。
2.2 抗性与感病基因型对SCMV的转录组响应
对FG1和Badila在五个时间点（0、6、18、48和192 hpi）的RNA-seq分析共鉴定出53,236个SCMV响应差异表达基因（DEG），其中FG1有37,524个，Badila有31,203个。两个基因型的DEG数量均在18 hpi达到峰值，但响应模式不同。FG1中上调基因占主导（29,871个上调 vs 19,961个下调），而Badila则呈现相反趋势（16,534个上调 vs 28,105个下调）。值得注意的是，FG1在18 hpi拥有最高数量的上调DEG（13,539个），并且其表达可持续至192 hpi。主成分分析（PCA）和层次聚类均显示，FG1和Badila具有明显不同的时间表达谱。基因本体（GO）分析强调了与代谢、应激响应和细胞组织相关的过程。
2.3 比较转录组揭示对SCMV的不同响应
直接比较FG1和Badila，在整个侵染时间进程中鉴定出24,296个DEG。基因型特异性DEG的数量随时间增加，在192 hpi达到最大。在6 hpi和192 hpi，FG1相对于Badila表现出更多的上调基因。GO富集分析表明，在早期时间点（0-6 hpi），FG1中上调的基因富集于基因表达和RNA代谢相关过程。在18 hpi，FG1中上调的DEG富集于细胞器组织和光合作用相关条目，而Badila则显示与应激和防御相关GO类别（如GO:0009605， GO:0006952）注释的基因表达减少。在192 hpi，与FG1相关的DEG富集于代谢和跨膜转运过程，而Badila则继续表现出广泛的转录改变。
2.4 共表达网络鉴定与病毒载量相关的模块
加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了19个基因共表达模块，其中4个与病毒RNA水平强烈相关（r >| 0.8|, p < 1e?5）。三个模块（棕色、绿色、薰衣草腮红3）与18 hpi相关。棕色模块在FG1-18 hpi达到峰值，而绿色-薰衣草模块在Badila-18 hpi占主导。在FG1中，棕色模块（281个DEG）富集于丙酮酸代谢（GO:0006090）和含氧化合物响应（GO:1901700），提示能量动员和活性氧（ROS）管理。在Badila中，绿色-薰衣草模块（328个DEG）则富集于分子伴侣活性（GO:0051131）、ROS响应（GO:0000302）和防御通路（GO:0009607）。
2.5 棕色与绿色-薰衣草模块中的枢纽基因定义抗性与感病性
与SCMV抗性相关的前30个上调基因在FG1的18 hpi表达达到峰值。这些DEG中包括了几种编码防御相关蛋白的基因，如过氧化物酶5、可能的过氧合酶4、硫醇甲基转移酶-2和AhpC/TSA抗氧化酶。FG1棕色模块中的顶级DEG包括与ROS解毒、转录调控和信号传导相关的ScPER5、ScNAC29、ScPXG4和ScCIPK21基因。ScCIPK21成为共表达网络中连接度最高的关键枢纽基因。小热激蛋白（sHSP）家族基因，包括ScHSP17.5，在Badila的18 hpi显著上调，与病毒复制峰值时间一致。这些基因在FG1中未观察到。sHSP家族基因在病毒感染中表现出显性表达。此外，ScHSP17.5被鉴定为感病网络中的关键节点。另一个sHSP基因ScHSP17.9A也显著上调，与FG1相比增加了18.2倍，尽管由于变异未达到统计学显著水平；RT-qPCR证实了它的高表达。
2.6 sHSPs通过与P3N-PIPO互作促进SCMV复制
在SCMV RNA复制高峰期，Badila中ScHSP17.5和ScHSP17.9A的转录水平升高。这些基因编码的蛋白分别包含157和165个氨基酸，均含有sHSP典型的α-晶体蛋白结构域（ACD）。对病毒RNA丰度的分析显示，编码外壳蛋白（CP）和P3的序列高于SCMV编码的其他蛋白。P3基因组区域通过转录滑移产生P3蛋白和融合蛋白P3N-PIPO，其中P3N-PIPO在病毒细胞间运动中起关键作用。酵母双杂交（Y2H）实验结果显示，P3N-PIPO、PIPO与这些sHSPs存在互作，而CP、P3或单独的P3N则未检测到互作。值得注意的是，PIPO与sHSPs产生了互作信号，而P3N没有；因此，PIPO结构域是P3N-PIPO与这些sHSPs结合的核心区域。在本氏烟中进行的双分子荧光互补（BiFC）实验显示细胞核和细胞质中均有荧光，支持了sHSPs与P3N-PIPO的体内互作。免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步验证了植物体内sHSPs与P3N-PIPO的互作。
为了评估sHSPs对SCMV RNA复制的影响，在本氏烟中进行了瞬时表达实验。当单独或共表达ScHSP17.5和ScHSP17.9A时，检测到高水平的转录本，而空载体（EV）对照中未发现表达。SCMV积累在6 hpi显示出一个复制高峰。结果表明，单独表达ScHSP17.5和ScHSP17.9A可使SCMV的积累在6 hpi时分别比EV对照增加19.4%和15.3%。值得注意的是，共表达ScHSP17.5和ScHSP17.9A能显著增强SCMV RNA水平，在6 hpi时达到EV对照水平的2.43倍。总之，通过多种实验证据，鉴定出与SCMV复制正相关的ScHSP17.5/17.9A与P3N-PIPO蛋白互作。
3 讨论
3.1 早期抗病毒响应是FG1抗性的基础
SCMV RNA的绝对定量揭示了抗性基因型FG1和感病品种Badila之间病毒动力学的显著差异。FG1在整个过程中维持低病毒载量并在192 hpi时清除了病毒，而Badila在18 hpi时出现尖锐的病毒峰值并在此后持续复制。这些对比鲜明的动力学表明，发生在早期侵染窗口期，特别是6至48 hpi之间的事件，对于决定侵染结果至关重要。FG1中缺乏水杨酸（SA）或茉莉酸（JA）相关通路的富集，以及快速、持续的转录激活，支持了激素非依赖性抗病毒响应的参与。相反，Badila表现出延迟的、主要以抑制为主的转录变化，这与限制早期病毒增殖能力降低相一致。这表明FG1的抗性基于早期转录介导的抗病毒活性。
3.2 FG1抗性与协调的氧化还原调控和信号控制相关
WGCNA鉴定出一个FG1特异性的基因模块（棕色），该模块富集了与氧化还原稳态和防御相关的转录本。这些酶可能支持了FG1解毒ROS和限制病毒传播的能力。同样在FG1中富集的ScNAC29，编码一个NAC转录因子，此前被认为与非生物胁迫和防御信号传导有关。在这里，ScNAC29的表达在FG1中被强烈诱导，而在Badila中没有；在本氏烟中瞬时表达会增加ROS活性并激活ROS相关基因。它在ROS积累和激活下游防御中的作用表明其有助于早期抗性。编码过氧化物酶的ScPER5和ScPXG4显著上调。ScPER5的瞬时过表达增强了过氧化物酶（POD）活性。过氧化物酶可强化细胞壁、调节ROS水平并介导病原体相关信号传导。ScCIPK21成为FG1模块内的一个枢纽基因。CIPK通过解码钙信号来调节胁迫响应。尽管CIPK21主要与非生物胁迫相关，但其在FG1中与ROS调节基因的共表达支持了其在抗病毒信号传导中的潜在作用。
ROS信号传导是抗性和感病植物-病毒互作中快速且必不可少的抗病毒防御组成部分。FG1的抗性与早期、协调的氧化还原通路激活相关，这些通路限制了SCMV的积累。这涉及到ROS作为一种防御信号的精确调控，从而有效诱导胁迫响应基因。相反，感病性的特征在于失调的ROS响应无法发动有效的防御，导致细胞损伤。抗性和感病品种之间ROS相关基因表达的差异可能反映了ROS信号传导不同的调控动态和结果，而非简单的防御激活存在与否。
3.3 P3N-PIPO招募宿主sHSPs以促进SCMV复制
sHSPs是在胁迫期间稳定未折叠蛋白并调节防御响应的分子伴侣。与FG1相反，感病甘蔗Badila表现出sHSP基因，特别是ScHSP17.5和ScHSP17.9A的表达升高，这与SCMV RNA复制峰值时间一致。ScHSP17.5被鉴定为感病网络中的关键节点。我们利用Y2H、BiFC和Co-IP证明，ScHSP17.5和ScHSP17.9A特异性与SCMV的运动蛋白P3N-PIPO互作。这两种sHSPs不与CP或P3互作，表明了一种选择性的病毒策略。PIPO（而非P3N）与sHSPs的互作表明PIPO是负责互作的关键结构域。因此，全长P3N-PIPO（而非P3）与sHSPs的互作直接归因于PIPO结构域的存在。功能实验进一步表明，表达任一种sHSP都会增加SCMV RNA复制，而共表达两种sHSPs则产生协同增强效应。这些数据支持了sHSPs有助于病毒在感病甘蔗中积累的解释。
最近的研究也证实P3N-PIPO与甘蔗蛋白（如ScPVA12和ScCML13）互作，调节亚细胞定位并可能支持病毒运动。这些发现支持了我们的模型，即SCMV劫持sHSPs来稳定复制复合物并逃避免疫响应。尽管sHSPs可以发挥抗病毒作用（例如在西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒时），但病毒经常利用分子伴侣来增强其自身的稳定性和运动。结合我们的发现，这些研究表明P3N-PIPO作为一个中心枢纽，招募支持SCMV感染的宿主因子。在Badila中，sHSP表达升高及其与P3N-PIPO的互作可能有利于病毒组分的稳定或运输，从而促进感染。
3.4 抗性与感病甘蔗中不同SCMV结局的工作模型
基于整合的转录组学、网络和功能分析，我们提出了一个关于甘蔗中SCMV感染结局的工作模型。在该模型中，早期感染诱导病毒蛋白（包括P3N-PIPO）的表达，这些蛋白与宿主因子结合以促进细胞间运动。在感病基因型如Badila中，SCMV与sHSPs表达增加相关，这些sHSPs与P3N-PIPO互作。这些sHSPs作为分子伴侣，重新折叠变性的蛋白质以保护宿主细胞免受不可逆的损伤。然而，这种保护机制也可能被SCMV蛋白P3N-PIPO劫持，以逃避免疫检测，从而促进SCMV的复制和传播。值得注意的是，这些sHSPs不与SCMV的CP和P3互作。尽管该模型提供了一个令人信服的解释，但进一步的功-能验证受到甘蔗多倍体遗传转化挑战的阻碍。
在抗性FG1中，氧化还原调节酶（ScPER5, ScPXG4）、转录因子（ScNAC29）和钙响应激酶（ScCIPK21）的早期激活可能在感染初始阶段限制病毒积累。这种协调的响应可能减少了病毒繁殖所需的宿主因子的可用性或有效性，从而防止持续感染。该模型需要更多来自甘蔗的功能证据来定义因果关系。
尽管甘蔗遗传复杂，但我们的发现为理解SCMV-宿主互作提供了机制性见解，并鉴定出与抗性和感病性相关的宿主通路。这些结果为未来研究提供了一个框架，并为培育或设计抗SCMV甘蔗品种提出了潜在靶点。
