《Pigment Cell & Melanoma Research》：QUILPEN Provides Independent and Label-Free Single-Cell Quantification of Pigmentation Dynamics and Organelle Content
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本文介绍了一种名为QUILPEN（无标记色素相关实体定量成像）的新型、无标记、多模态活细胞成像技术。它巧妙结合定量相位成像（QPI）、四分区暗场（QDF）和吸收成像，首次实现了在活体细胞中独立、实时、动态地量化黑色素含量与黑色素体含量。该技术突破了传统方法（如流式侧向散射SSC）无法区分色素与细胞器、依赖标记或具有破坏性的局限，为在单细胞水平解析黑色素生成、色素沉着异质性及其在细胞谱系中的可遗传性提供了强大工具，对理解黑色素细胞生物学、黑色素瘤进展与治疗反应具有重要科学价值。
引言
黑色素细胞以其合成、包装和分布黑色素的能力而著称。色素沉着表型与特定的细胞行为和发育程序相关。在黑色素瘤中，色素沉着相关基因表达与预后相关，且色素本身影响免疫识别和治疗反应。然而，色素含量与转录程序并不总是一致，且在单细胞分辨率下，其关系变得尤为复杂。这凸显了对能够在活细胞中直接测量色素并随时间捕获相关细胞特征的工具的迫切需求。当前对黑色素合成的理解主要基于在离散时间点进行的批量分析，如光谱法、质谱法或高效液相色谱法（HPLC），以及免疫荧光、电子显微镜等成像方法。这些方法本质上是破坏性的，需要标记或固定，无法进行活细胞分析。主要的无损技术是流式细胞术侧向散射（SSC），它虽与细胞内颗粒度相关，但无法区分黑色素含量与其他影响颗粒度的细胞特征（如黑色素体含量），也不允许在活细胞中进行动态追踪。由于黑色素在宽光谱范围内强烈吸收和散射光的特性，在单个活细胞中量化黑色素在技术上具有挑战性，阻碍了色素含量的定量评估，并使荧光报告基因或染料的使用复杂化。
QUILPEN技术原理与测量
为应对上述挑战，研究团队开发了QUILPEN（无标记色素相关实体定量成像）技术。这是一种基于定制多模态定量相位成像显微镜的无标记、非破坏性、低光毒性成像方法，能够独立测量透射光、散射光和吸收光。该技术整合了定量相位成像（QPI）、吸收成像和四分区暗场成像（QDF）。
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定量相位成像（QPI）：通过测量光穿过样本时的相位偏移，提供细胞干物质的空间分布图，可用于测量形态特征、识别细胞分裂并提供单细胞生长速率测量。
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吸收成像：在QPI后处理中恢复被样本吸收的光，生成独立的吸收图像。吸收被证明是黑色素含量的可靠读数。
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四分区暗场成像（QDF）：一种利用来自数值孔径外的定向照明，随后数学消除具有方向性偏倚散射特征的暗场显微镜形式。QDF增强了细胞内小而致密物体的检测，同时消除了传统暗场显微镜中细胞边缘的散射干扰。QDF测量散射光，可检测黑色素体含量。
QUILPEN成像流程能够在标准组织培养箱内进行，使用低光毒性光源，允许对活样本进行长时间成像而不影响细胞活力。
QUILPEN区分黑色素含量与细胞器丰度
研究人员应用QUILPEN技术，验证了其区分黑色素（吸收信号）和黑色素体/细胞器（QDF散射信号）的能力。
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在不同色素沉着程度的细胞系中验证：在轻度色素沉着的肢端黑色素瘤细胞系（ASM021）和重度色素沉着的细胞系（AM084）中，吸收和QDF信号均呈正相关，但具体比例关系因细胞类型而异。在无色素沉着的黑色素瘤细胞系SK-MEL-28（富含未成熟黑色素体）和重度色素沉着的MNT-1细胞（富含成熟黑色素体）中，尽管两者黑色素含量差异巨大，但QDF信号分布有重叠，表明SK-MEL-28细胞的黑色素体总量可能等于或大于MNT-1细胞。吸收与QDF的相关性斜率在这两种细胞系间存在显著差异，表明QDF反映的是细胞器含量，而非由黑色素驱动的散射，也不依赖于黑色素体的成熟度。
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通过药理学干预直接验证：使用酪氨酸酶可逆抑制剂N-苯基硫脲（PTU）长期处理MNT-1细胞以抑制黑色素合成但不影响黑色素体生物合成。PTU处理的细胞吸收信号显著降低，但QDF信号与DMSO对照组相似，直接证明了黑色素含量丢失而黑色素体得以保留。同样，PTU处理细胞的吸收-QDF斜率与对照组不同。
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与流式细胞术侧向散射（SSC）比较：作为常用的色素含量替代指标，SSC在MNT-1和SK-MEL-28细胞间差异不大，但在PTU处理和未处理的MNT-1细胞间却有显著差异。这表明SSC信号无法区分颗粒度（细胞器）和黑色素含量，而QUILPEN能够解耦这两个信号。
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设定非黑色素细胞基线：在缺乏黑色素体生物合成机制的永生化视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE-1）中，QUILPEN检测到低且均一的QDF和吸收信号，为非黑色素相关的细胞器贡献提供了基线。
QUILPEN捕捉色素再沉着动态
去除PTU后，对MNT-1细胞进行长时间活细胞成像，追踪色素恢复过程。结果表明，吸收信号能够捕捉到色素再沉着的动态过程，而QDF信号在去除PTU前后保持稳定，表明黑色素体含量处于稳态。在群体水平，PTU处理细胞在去除抑制剂后，吸收信号逐渐恢复，并在约120小时内达到与DMSO对照组相似的水平，且恢复后的吸收信号异质性分布得以重建，表明细胞不仅恢复了总色素量，也恢复了其相对的色素沉着状态。单细胞追踪进一步揭示了色素恢复动力学的显著异质性，不同细胞的色素合成速率和程度存在很大差异。
细胞谱系中色素相关特征的可变遗传
通过结合QPI的细胞分割与追踪功能，以及交互式数据可视化工具Loon，研究团队构建了细胞谱系树，并叠加了吸收和散射数据，以研究色素相关特征的遗传模式。
在去除PTU后的MNT-1细胞中，谱系追踪显示，在细胞生长阶段，吸收信号以可变速率增加。细胞分裂后，子代细胞对色素含量的继承方式多样，包括对称性继承（子代细胞色素含量相近）和非对称性继承（子代细胞色素含量不同）。此外，子代细胞在分裂后仍表现出不同的吸收增加速率，表明色素恢复能力不仅取决于继承时的色素量，还可能独立于黑色素体数量被非对称地遗传。相比之下，QDF信号在谱系中表现出更对称的遗传模式和更平缓的增加，表明细胞器含量在子代细胞间分配更为均等。
这些发现表明，黑色素体含量可能在细胞间均等分配，而负载黑色素的黑色素体可能被不均等继承，导致色素在一个子细胞中富集。色素合成能力也可能独立于黑色素体数量被非对称地遗传。
讨论与展望
QUILPEN技术的开发，实现了在活体单细胞水平解耦黑色素含量与黑色素体丰度的量化。它揭示了即使在遗传相同的细胞中，黑色素体含量和色素沉着也存在显著异质性，且吸收与QDF信号的关系在不同细胞类型和色素状态下是可变的。该技术克服了传统流式SSC的局限性，为研究黑色素生成和黑色素体生物学提供了高时空分辨率的新平台。
未来的工作方向包括：探索不同照明波长对吸收和散射信号解读的影响，以区分真黑素与褐黑素或其他细胞内结构；整合荧光报告基因，将细胞器/黑色素含量与基因表达、细胞内pH、代谢状态等分子标记关联；以及利用机器学习工具改进定量相位图像的自动分割和谱系追踪，提高分析通量。
总之，QUILPEN为在无标记、无扰动条件下，以高时空分辨率精确剖析色素合成动力学、遗传和异质性提供了新的平台。通过解耦色素沉着与其他细胞特征，QUILPEN为探索黑色素生产如何与基因表达、分化状态、应激反应和疾病进程相互作用开辟了新途径，这些见解不仅对黑色素瘤，而且对色素性疾病、发育生物学以及黑色素细胞在不同组织中的功能多样化都具有广泛意义。
