对红树林（Avicennia marina）中AP2/ERF基因家族进行的全基因组研究发现，AmERF1通过调节脯氨酸生物合成和H?O?稳态，在提高植物耐盐性方面起着关键作用

《Plant Science》：A genome-wide study of the AP2/ ERF gene family in mangrove Avicennia marina reveals the role of AmERF1 in salt tolerance through mediating proline biosynthesis and H?O? homeostasis

红树林先锋物种A. marina中鉴定出236个AP2/ERF转录因子家族成员，分类为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist五个亚家族。通过转录组学与RT-qPCR验证AmERF1参与高盐胁迫响应，其通过直接激活AmP5CS1（参与脯氨酸合成）和AmAPX1（维持H2O2稳态）增强盐胁迫耐受性，并在烟草瞬时过表达系统中功能验证。本研究揭示了A. marina适应高盐环境的分子机制并为作物耐盐遗传改良提供理论依据。

　　

刘家坤|唐汉臣|孙玲|王继成|黄和子|庄丽涵|郭兆宇|洪星月|张玉鹏|郑海雷

中国教育部亚热带湿地生态系统研究重点实验室，厦门大学环境与生态学院，福建省厦门市361102

摘要：

Avicennia marina是一种先锋红树物种，能够很好地适应热带和亚热带沿海潮间带的高盐度环境。AP2/ERF是植物中最大的转录因子家族之一，在非生物胁迫响应中起着关键作用。然而，关于A. marina中AP2/ERF家族的系统研究尚未开展。在这项研究中，我们从A. marina的全基因组数据库中鉴定出了236个AmAP2成员，这些成员被分为五个亚家族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。通过转录组学和RT-qPCR分析，我们发现AmERF1是参与A. marina高盐度响应的候选基因。随后在烟草叶片中进行了瞬时过表达实验，验证了AmERF1在耐盐性中的潜在作用，并对其功能进行了研究。荧光素酶（LUC）和酵母单杂交（Y1H）实验表明，AmERF1直接结合到Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶1（AmP5CS1）和抗坏血酸过氧化物酶1（AmAPX1）的启动子中的脱水响应元件（DRE）上，这两种酶分别与脯氨酸生物合成和H₂O₂稳态相关。我们的研究表明，AmERF1通过激活AmP5CS1和AmAPX1的表达来促进A. marina的耐盐性，为红树适应高盐度环境提供了理论基础，并为提高作物耐盐性提供了遗传策略。

引言

盐胁迫通常通过破坏离子和渗透平衡以及引起氧化损伤来限制植物生长（Chen等人，2021年）。然而，先锋红树物种Avicennia marina却在热带和亚热带海岸的高盐度潮间带环境中茁壮成长（Das等人，2016年）。A. marina对潮间带环境的适应性来源于多种机制，如排盐叶腺、选择性根系过滤、多肉叶片以及隐胎生殖（Kathiresan和Bingham，2001年；Guo等人，2023年）。

转录因子（TFs）通过结合特定的cis元件（主要是启动子）来调控基因表达，从而驱动细胞代谢和生理在胁迫下的重编程（Agarwal等人，2017年）。APETALA2/ETHYLEN E RESPONSE FACTOR（AP2/ERF）超家族的特点是具有保守的AP2结构域，该结构域能够结合下游基因启动子中的脱水响应元件（DRE）和GCC-box，从而指导转录重编程（Nakano等人，2006年）。

正如先前的研究所示，AP2/ERF成员在高盐度和干旱等胁迫条件下可以直接激活耐盐相关基因（Feng等人，2020年；Sakuma等人，2002年；Li等人，2019b年）。例如，在烟草（Nicotiana tabacum）中，ERF13a通过促进苯丙烷类化合物的生物合成来提高耐旱性和耐盐性（Wang等人，2023年）。同样，在Arabidopsis thaliana中，AtERF1通过茉莉酸（JA）、乙烯和ABA信号通路来正向调节耐盐性和耐旱性（Cheng等人，2013年）。此外，在转基因Arabidopsis中，AtNIGT1.4通过诱导ERF1来维持主根生长（Hu等人，2023年）。在转基因Arabidopsis中，IbRAP2-12基因来自甘薯（Ipomoea batatas），能够提高耐盐性和耐旱性（Li等人，2019b年）。在水稻（Oryza sativa中，OsERF1在早期盐胁迫期间调节活性氧（ROS）依赖的信号通路（Schmidt等人，2013年）。

此外，脯氨酸作为一种关键的渗透调节物质，不仅维持了细胞的渗透势，还有助于酶的稳定、离子平衡和ROS的清除（Ghosh等人，2022年）。跨物种的实验证据证实了脯氨酸的保护作用，例如外源脯氨酸可以降低水稻在盐胁迫下的Na?/K?比例（Nounjan等人，2012年）。在鹰嘴豆（Cicer arietinum）中，外源脯氨酸可以增强抗氧化酶的活性、光合作用和产量（Hayat等人，2013年）。同样，在烟草细胞中，外源脯氨酸可以恢复膜完整性（Islam等人，2009年）。

另一方面，ROS在低浓度下可以调节生理过程，但在高浓度下则会引起氧化损伤（Gill和Tuteja，2010年；Farooq等人，2019年）。在ROS中，过氧化氢（H?O?）由于其独特的稳定性和膜通透性而成为主要的信号介质（Farooq等人，2019年；Zhao等人，2020年；Bienert等人，2006年；Bienert等人，2007年）。例如，H?O?通过ANP1（一种MAPK激酶激酶）激活MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联反应，从而增强ERF6的转录活性（Kovtun等人，2000年；Vogel等人，2014年）。H?O?还增强了水杨酸介导的信号通路，导致程序性细胞死亡（PCD）（Vandenabeele等人，2003年）。在ABA信号通路中，H?O?激活保卫细胞中的Ca2?通道，促进K?外流和膨压降低，从而导致气孔关闭（Farooq等人，2019年；Zhang等人，2001年）。此外，H?O?引起的氧化修饰促使HSFA8在Arabidopsis中核定位，进而结合目标基因以响应热应力（Liu等人，2013年）。

然而，关于红树A.marina（AmAP2）中AP2/ERF家族基因的生物信息学研究仍不充分。另一个关键问题是AmAP2是否通过参与脯氨酸生物合成或H?O?稳态的下游靶标来调节A. marina的耐盐性。

在这项研究中，我们从A.marina中鉴定出了236个AmAP2成员，并将其分为五个亚家族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。其中，AmERF1被确定为一种强盐响应候选基因，编码一种核定位蛋白。由于A. marina缺乏稳定的过表达系统，我们在Nicotiana benthamiana中进行了瞬时过表达实验，结果发现AmERF1能够提高耐盐性并改善生理指标。此外，荧光素酶（LUC）和酵母单杂交（Y1H）实验表明，AmERF1直接激活参与脯氨酸生物合成的Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶1（AmP5CS1）和参与H?O?稳态的抗坏血酸过氧化物酶1（AmAPX1）。这些发现揭示了A. marina的核心适应机制，并将AmERF1确定为提高作物耐盐性的重要基因。

植物材料与处理

从中国福建省漳江口红树林国家自然保护区（23°55′N, 117°26′E）收集了A. marina的新鲜果实。种子经过表面消毒后，通过浸泡在蒸馏水中进行发芽处理。随后选择生长旺盛的幼苗，并将其移植到含有无菌沙土的盆中。植物在环境控制的生长室中培养，温度保持在25°C，相对湿度为65%，光照时间为12小时，黑暗时间为12小时。

在A. marina中鉴定和表征AmAP2

全基因组分析从A. marina的基因组中鉴定出了236个AP2/ERF家族成员，编号为AmAP2-1至AmAP2-236（表S3）。这些蛋白质在氨基酸数量（132–1108个氨基酸，平均296个氨基酸）和分子量（14.96–125.61 kDa）上存在显著差异。它们的等电点（pI）显示，51.3%为酸性（pI < 6.5），41.1%为碱性（pI > 7.5），只有7.6%为中性。大多数成员（95.8%）被预测为不稳定（不稳定性指数 > 40），并且所有成员都

在A. marina中鉴定和表征AmAP2

基因家族分析为物种进化、生物过程和环境适应提供了宝贵的见解（Feng等人，2023年）。虽然A. marina的基因组资源已经使得包括MYB（Pradhan等人，2021年）、NAC（Song等人，2023年）、Snakin/GASA（Shang等人，2023年）、MATE（Shijili等人，2023年）、WRKY（Feng等人，2023年）、TCP（Li等人，2024年）和bHLH（Tang等人，2025年）在内的多个基因家族的表征成为可能，但AP2/ERF转录因子在其适应过程中的作用仍需进一步研究

结论

本研究对红树A. marina中的AP2/ERF转录因子家族进行了全基因组鉴定和表征，共鉴定出236个成员，这些成员被分为五个不同的亚家族。进化分析表明，该家族经历了纯化选择，同时保持了结构保守性，并通过全基因组和片段复制事件发展出了物种特异性的适应性。在高盐度条件下的启动子分析和表达谱分析进一步揭示了

作者贡献

实验的构思和设计：H-LZ负责实验的构思和设计。HT、LS和JL准备了实验材料。JL进行了实验数据分析。JL、HT、JW和XH共同分析了数据。JL、HH、LZ、ZG和YZ负责图表的整理。所有作者共同审阅并批准了最终稿件。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（NSFC 32171740）、国家重点研发计划（2017YFC0506102）以及厦门大学本科生创新创业培训计划（202410384087）的财政支持。

CRediT作者贡献声明

庄丽涵：正式数据分析。黄和子：正式数据分析。王继成：验证、数据管理。孙玲：监督、资源提供、方法学指导。唐汉臣：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源提供、方法学指导。刘家坤：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、验证、调查、正式数据分析、数据管理。郑海雷：撰写、审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金申请

利益冲突

作者声明在本研究中不存在利益冲突。

致谢

我们感谢编辑和匿名审稿人的宝贵建议和富有洞察力的评论。