通过比较基因组学和功能分析，发现MePPO是木薯储藏根采后生理退化过程中的关键调控因子

《Postharvest Biology and Technology》：Comparative genomic and functional analyses identify MePPO as a key regulator of postharvest physiological deterioration in cassava storage roots

本研究鉴定了卡萨瓦中一个MePPO基因，通过多物种比较分析其理化特性、进化关系及基因结构，发现MePPO在根和叶中高表达。病毒诱导基因沉默（VIGS）MePPO显著延缓储存根褐变，降低PPO活性及儿茶素前体，同时提高抗坏血酸积累。结论：靶向抑制MePPO可有效缓解木薯褐变。

　　

马艳艳|朱文丽|薛茂富|陈松碧

中国海南省海口市海南大学生命科学学院热带作物育种国家重点实验室，邮编570228

摘要

木薯的储藏根（SRs）是全球重要的主食和工业资源。然而，储藏根在收获后极易发生采后生理退化（PPD），其特征是维管组织出现蓝褐色变色。这种变色是由于多酚类物质（主要是醌类和香豆素类）的积累，这些物质是由多酚氧化酶（PPO）等酶产生的。我们在木薯（Manihot esculenta）基因组中鉴定出一个MePPO基因，并对多种植物物种中的PPO同源基因进行了比较分析。我们详细比较和分析了它们的物理化学性质、进化关系、基因结构、染色体定位、保守基序、顺式作用元件、基因重复以及基因共线性。表达谱分析显示，MePPO主要在木薯的根和叶中表达。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默MePPO后，显著延缓了木薯储藏根的PPD发生和发展，尤其是在收获后的第6天和第9天。沉默后的植株表现出较低的PPO转录水平和酶活性，并且在收获后第3天时，与PPD相关的关键香豆素——斑鸠菊素（scopoletin）的含量也显著下降。值得注意的是，沉默后的木薯中黄烷醇（儿茶素）的积累有所增加。总之，这些发现表明，靶向抑制MePPO可以有效缓解木薯储藏根的PPD现象。

引言

木薯是热带和亚热带地区近十亿人的重要主食（Djabou等人，2017年；An等人，2023年）。然而，木薯的储藏根非常容易发生PPD。这一过程在收获后24-72小时内开始，导致其适口性和市场价值迅速下降（Saravanan等人，2016年；Djabou等人，2017年）。PPD的特点是在机械损伤部位发生快速的氧化反应，随后与抗氧化防御相关的基因表达发生变化，并积累酚类次生代谢物（Beeching，1998年；Wu等人，2019年；Wu等人，2022年）。维管组织的变色是由复杂的多酚类物质（如斑鸠菊素、东莨菪素和esculetin）的酶促形成引起的（Zainuddin等人，2018年；Ma等人，2022年）。这些化合物通过羟基香豆素生物合成途径产生，需要PPO酶的参与（Wu等人，2022年）。

香豆素类物质的生物合成途径中，香豆酰基莽草酸/奎宁酸3′-羟化酶（C3'H）和香豆酰基辅酶A 6′-羟化酶（F6′H）起着关键作用（Fritig等人，1970年；Fernández-Pachón等人，2004年；Morant等人，2007年）。敲低C3'H基因可以延缓储藏根的PPD（Ma等人，2022年）。通过RNAi抑制F6′H可以减少斑鸠菊素的合成，从而延缓PPD（Shi等人，2017年）。PPO在香蕉（Musa acuminata）、马铃薯（Solanum tuberosum）和核桃（Juglans regia）中的褐变过程中的作用也已被深入研究（Chi等人，2014年；Qin等人，2023年；Wang等人，2024年）。PPO催化单酚和邻二醇类物质的氧化，生成相应的邻醌，这些邻醌会与非酶物质（如氨基酸和蛋白质）发生聚合反应，形成棕色沉淀物（Friedman，1996年；van Gelder等人，2010年；Tran等人，2012年）。

在这里，我们利用不同的植物基因组鉴定出了木薯中的一个MePPO基因，并对多种植物物种中的PPO进行了比较基因组分析。此外，还表征了异源表达的MePPO的物理化学性质、组织特异性表达和酶活性。通过VIGS技术在木薯中沉默MePPO，以探讨PPO活性、木薯香豆素和PPD之间的关系。这些发现表明MePPO在木薯PPD过程中起着重要作用。

部分内容摘要

PPO基因家族的鉴定与特征分析

为了鉴定多种植物基因组中的PPO家族基因，

我们使用了Pfam数据库中的三个特征结构域的HMM模型：PPO1_KFDV（PF12143）、酪氨酸酶（PF00264）和PPO1_DWL（PF12142）（http://pfam.janelia.org/）。所有候选的PPO序列还通过保守结构域数据库（CDD，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART数据库（https://smart.embl.de/进行了进一步验证（Ma等人，2023年）。鉴定的PPOs的关键物理化学性质包括

木薯中PPO的鉴定与分析

在木薯（Manihot esculenta）基因组中，我们在第7号染色体上鉴定出一个MePPO基因。其编码序列（CDS）长度为1764 bp，编码一个包含587个氨基酸的蛋白质。推断出的MePPO蛋白的分子量为65.86 kDa，等电点（pI）为6.03。其他计算参数包括不稳定性指数43.06和GRAVY评分-0.530（表1）。推断出的MePPO蛋白属于酪氨酸酶超家族，具有保守的双核结构

PPO的表征与进化

不同植物物种中的PPO基因数量存在显著差异。研究表明，苔藓和杨树分别含有13个和18个PPO基因，而大豆含有11个；相比之下，水稻、蓖麻和木薯各含有1个，拟南芥则不含PPO基因（Van der Hoeven等人，2002年；Tran等人，2012年）。其他氧化酶家族（如III型过氧化物酶（POD）和漆酶）也能催化酚类化合物的氧化，但它们在功能上并不完全冗余

结论

总结来说，我们对PPO基因进行了多物种比较分析，包括系统发育分析、基因结构、染色体定位、保守结构域、顺式作用元件、基因重复事件以及基因共线性研究。我们在木薯中鉴定出一个MePPO基因，该基因主要在叶片和根部表达。通过原核细胞表达实验验证了MePPO具有二酚氧化酶活性。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默MePPO

CRediT作者贡献声明

薛茂富：资源获取。陈松碧：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金申请。朱文丽：数据验证、正式分析、数据管理。马艳艳：初稿撰写、方法设计、实验研究、正式分析、数据管理。

伦理合规性

本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理规范。

资金支持

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1200201）、热带作物育种国家重点实验室项目（项目编号：SKLTCBYWF202506）、中国中央公共利益科学机构基础研究基金（项目编号：1630032022007）以及省级重点实验室开放项目（项目编号：1630032025028）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。