《Postharvest Biology and Technology》：The application of
Cryptococcus laurentii induced by carboxymethyl chitosan remodeled the microbiome of fruit peel and reduced postharvest green mould in grapefruit
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葡萄柚后熟病害的生物防治研究显示，壳聚糖诱导的Cryptococcus laurentii（CMCS-C. laurentii）显著降低腐烂 incidence并调节微生物群落，其中Papiliotrema属丰度增加，而Penicillium等致病菌减少，同时保持果实品质和色泽。
梁阳|肖良军|刘先宇|刘超|叶涵|杜荣宇|何晓红|王芳|邓佳
中国云南省昆明市西南林业大学林业学院，邮编650224
摘要
葡萄柚产业面临着由Penicillium属真菌引起的采后病害这一重大挑战。生物控制正逐渐被视为替代化学杀菌剂的有效方法来管理这些病害。本研究考察了由羧甲基壳聚糖（CMCS-C. laurentii）诱导的Cryptococcus laurentii对采后病害的生物控制效果，并利用扩增子测序技术分析了葡萄柚果皮上的微生物群落。结果表明，CMCS-C. laurentii显著降低了病害发生率，并对微生物群落中的真菌多样性产生了比细菌多样性更明显的影响。值得注意的是，处理组中Papiliotrema（属于Cryptococcus属）属的微生物显著增加，而Zasmidium、Penicillium和Cladosporium属的微生物数量相对于对照组有所减少。此外，CMCS-C. laurentii还保持了水果的质量并减少了其颜色变化。这些结果表明，CMCS-C. laurentii通过改变细菌和真菌群落的结构，具有减轻植物病原体、降低果实病害发生率以及维持高质量采后葡萄柚的潜力。
引言
葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）因其清新的口感以及营养价值和健康益处而受到全球的重视（Hung等人，2017年）。然而，主要由真菌病原体引发的采后病害在运输和储存过程中会导致显著的营养价值和经济损失（Shi等人，2018年）。影响葡萄柚的最主要采后病害是蓝霉病和绿霉病，这两种病害均由Penicillium属真菌引起（Olmedo等人，2023年；Wu等人，2024年）。
对于柑橘类水果采后病害的有效管理需求日益增加。传统上，人们常用化学杀菌剂来预防和控制这些病害（Li等人，2021年）。然而，人们对化学杀菌剂的负面影响（包括病原体抗性、环境污染和潜在的人类健康风险）表示担忧，这突显了寻找有效且环保的病害管理方法的紧迫性（Deng等人，2020年）。因此，越来越多的研究集中在利用生物控制方法来提高果实采后的抗性上（Bautista-Rosales等人，2013年；Wei等人，2014年）。其中，利用拮抗酵母是一种备受关注的关键策略，它通过竞争营养物质和空间来抑制病原体的生长（Zhang等人，2019年）。
早期的研究主要集中在微生物拮抗剂、病原体和果实之间的相互作用机制上。然而，利用拮抗微生物来管理采后果实病害需要将其整合到自然复杂的微生物环境中（K?hl等人，2019年）。微生物在果实采后发育、处理和储存过程中起着关键作用，包括有益微生物、有害微生物和导致腐败的微生物（Wassermann等人，2019年；Lane等人，2024年）。有益微生物通过直接影响果实中的营养物质水平对果实质量产生重要影响（Bourdichon等人，2012年；Wang等人，2011a）。同时，果实采后病害的发生与有害真菌的生长有关，这些真菌会破坏微生物的平衡（Berg等人，2020年）。最近的研究表明，拮抗酵母可以通过改变果实上的微生物群落来提高樱桃番茄（Liu等人，2020年）和苹果（Remolif等人，2024年）的储存耐受力。深入理解微生物群落内的相互作用可能为创新的生物控制技术提供更多可能性，以应对采后果实病害（Zhang等人，2021a）。
近年来，Cryptococcus laurentii作为一种用于生物控制的微生物菌株受到了广泛研究。它已被证明能有效控制多种采后病害，并增强芒果、草莓、桃子和樱桃番茄等果实的抗性机制，从而抑制Alternaria alternate、Penicillium expansum、Colletotrichum gloeosporioides和Botrytis cinerea等病原体的生长（Bautista-Rosales等人，2014年；Wei等人，2014年；Zhang等人，2017年；Lai等人，2018年）。尽管拮抗酵母具有潜力，但它们的效果通常不如合成杀菌剂。然而，添加诱导剂可以显著提升C. laurentii的生物控制效果。研究表明，肉桂酸和硼能够通过破坏病原真菌的细胞膜并促进酵母的增殖来增强C. laurentii对Penicillium属真菌的生物控制能力（Li等人，2019年；Cao等人，2012年）。我们之前的研究证明，羧甲基壳聚糖（CMCS）为C. laurentii提供了必需的营养物质，从而促进了其生长和繁殖能力。此外，诱导处理显著增强了细胞外水解酶和抗氧化剂的活性，共同抑制了病原体的发展（Wu等人，2024年；Xia等人，2025年）。虽然CMCS不仅为C. laurentii提供了营养支持，还激活了其生物控制机制，但以往的研究主要集中在酵母本身上，对与葡萄柚相关的微生物群落的影响研究较少。
本研究旨在探讨CMCS诱导的C. laurentii（CMCS-C. laurentii）对葡萄柚的影响，重点关注其在储存期间减少病害发生率的效果。我们利用扩增子测序技术分析了葡萄柚上的真菌和细菌群落的变化，并研究了CMCS-C. laurentii通过与其相关微生物属的相互作用及其对葡萄柚质量的影响来控制采后病害的机制。
实验部分
果实样本
本研究使用的葡萄柚采自中国云南省昆明的金马镇市场。这些葡萄柚经过挑选，确保其健康、大小一致且无感染或损伤。
试剂、病原体和拮抗菌株
CMCS由辽宁大连的美仑生物技术有限公司提供，其pH值在8.0到10.0之间，羧基化程度至少为80%。
P. digitatum由我们的研究团队从受感染的葡萄柚表面分离获得。从该病原体中提取了DNA。
C. laurentii和CMCS-C. laurentii处理对体外抗真菌活性及葡萄柚的影响
体外实验显示，与对照组相比，经过C. laurentii和CMCS-C. laurentii处理的组中P. digitatum的菌落直径有所减小（图1A和B）。在整个储存期间，CMCS-C. laurentii处理的组中菌落直径显著减小。在第10天时，CMCS-C. laurentii处理组的菌落直径为3.03厘米，比对照组减少了41.29%。
讨论
在采后储存过程中，柑橘类水果极易受到Penicillium属真菌的感染，导致病害和严重的经济损失（Guo等人，2014年）。从果实表面分离得到的C. laurentii在控制葡萄柚绿霉病方面表现出显著效果（Deng等人，2021年）。然而，单独使用生物控制酵母通常效果不如化学杀菌剂，这表明需要提高其在柑橘种植中的拮抗效果。
结论
我们的数据表明，应用CMCS-C. laurentii在体外和葡萄柚中均能有效抑制P. digitatum的生长，显著减少了病斑直径和绿霉病的发生。CMCS-C. laurentii在葡萄柚上具有强大的定殖能力，并减少了病原真菌的数量。它显著改变了真菌和细菌群落的组成和多样性。
作者贡献声明
邓佳：撰写、审稿与编辑、软件使用、方法论设计、概念构建。刘先宇：数据可视化、方法论设计。梁阳：概念构建、撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据管理。王芳：概念构建。杜荣宇：数据可视化、方法论设计。叶涵：数据可视化、方法论设计。刘超：数据可视化、方法论设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
本手稿的提交不存在利益冲突；所有作者均同意发表该手稿，该手稿未在其他地方接受发表审核，所描述的工作也未曾发表。作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32160394、32460409）、中国农业研究系统（CARS-21）、云南省高层次人才培训支持计划（YNWR-QNBJ-2020–205）、云南省中青年学术技术领军人才储备计划（202105AC160045）、云南省西南林业大学一级林业建设学科（LXXK-2024Z08）以及其他相关项目的支持。
