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SPAD阵列时间分辨检测技术扩展了荧光酶联免疫分析的动态范围，通过光子到达衰减常数τ实现高浓度检测，并与卷积神经网络结合实现无需校准的直接浓度推断，在流感B检测中检测限达0.0034 ng/mL。
S. Moreno|O. Caravaca-Müller|X. García-Fernández|M.B. Jaballah|A. Vilà|E. Baldrich|A. Diéguez
巴塞罗那大学（UB）物理学院电子与生物医学工程系，西班牙巴塞罗那
摘要
许多生物分析方法会产生比色读数，颜色强度可以提供目标分析物浓度的信息。然而，传统的吸光度读数仪在高分析物浓度下往往会饱和，当分析物的浓度范围较广时，就需要对样本进行连续稀释。在这里，我们介绍了一种基于单光子雪崩二极管（SPAD）阵列的便携式读数仪，该读数仪通过像素内的时间分辨光子计数来量化宽动态范围内的吸光度。该方法依赖于基于寿命的测量原理，其中吸光度是从光子到达衰减常数（τ）而不是稳态强度推导出来的，从而能够在高通量条件下实现精确的量化。我们将这种方法应用于B型流感核蛋白的磁颗粒免疫测定。基于SPAD的读数仪在可用动态范围内保持了单调的响应，最高可达64 ng/mL^-1，而商用光度计在超过12.5 ng/mL^-1时会出现信号饱和现象，其检测限（LoD）和定量限（LoQ）分别为0.0034 ng/mL^-1和0.0949 ng/mL^-1，同时变异系数（CV）小于10%。通过在16个bin的直方图上训练的卷积神经网络能够准确推断出分析物浓度（R^2 = 0.986），其结果与基于τ的校准结果一致，这表明相同的时间分辨光子信息可以通过物理建模或数据驱动的推断来定量解释。通过扩展可用吸光度范围同时保持灵敏度，这种方法改进了与商用台式设备相比的关键分析性能指标，为高性能便携式即时检测（PoC）解决方案铺平了道路。
引言
酶联免疫测定是一种广泛使用的分析方法，它结合了抗体的特异性和酶标签提供的定量信号生成能力。当与比色检测结合时，酶反应会产生一种有色化合物，其颜色强度与分析物浓度相关，通常通过光学吸光度来测量[1,2]。虽然这种方法非常稳健且被广泛采用，但它依赖于体积庞大、成本高昂的台式读数仪，并且仅限于中心实验室使用。此外，这些读数仪的检测动态范围通常受到限制，特别是在高酶浓度导致强吸光信号时，低透射强度会达到仪器的背景噪声，从而导致响应平台化并失去定量精度。然而，需要区分仪器饱和和特定于检测的非线性，后者可能是由于反应动力学或高分析物浓度下的底物耗尽等因素引起的。虽然生物测定的固有局限性无法通过光学硬件来克服，但传统检测器的有限动态范围常常会带来额外的、可避免的瓶颈。这些综合限制阻碍了在宽分析物浓度范围内的准确量化。
即时检测（PoC）诊断设备在扩大医疗保健可及性方面发挥着关键作用，特别是在资源有限或分散的环境中。这些设备能够在患者护理现场或附近提供快速结果，从而减少诊断周转时间并促进即时临床决策[[3], [4], [5]]。由于其多功能性、易于集成以及与多种生化检测的兼容性，光学检测在这些平台中被广泛使用[6,7]。然而，许多便携式光学PoC读数仪采用简化的光电二极管检测器或低成本成像传感器，这些传感器的灵敏度和动态范围通常比实验室级设备有限。当使用产生强吸光信号的酶系统时，这种限制尤其成问题，例如使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）作为显色剂的辣根过氧化物酶（HRP）标签的检测。虽然已有报道关于HRP–TMB检测的PoC平台，但大多数平台在不采用光学衰减或多重样本稀释的情况下无法扩展所需的动态范围。已经探索了几种替代策略来解决这个问题，包括使用荧光底物来扩展检测范围[8]、提高灵敏度的电化学读数[9]、用于便携式检测的电泳-滴定芯片[10]以及具有宽动态范围的微流控化学发光免疫阵列[11]。然而，这些方法通常需要专门的仪器、复杂的微流控技术或先进的制造方法，这可能限制了它们转化为简单、低成本的PoC设备。
在这里，我们介绍了一种用于基于吸光度检测的便携式PoC系统，专为资源有限环境中的独立样本分析而设计。为了确保在现场的操作稳健性和重复性，该平台采用了最小组件、无透镜的架构，具有固定的光学路径且没有活动部件（“设置即用”对齐方式）。通过利用扩展可量化动态范围的时间分辨测量原理，该系统无需复杂的样本连续稀释即可直接进行测量。该设备集成了基于单光子雪崩二极管（SPAD）的CMOS传感器和像素内模拟直方图技术，这种技术在生物光子应用中以其单光子灵敏度和宽动态范围而闻名[12]。SPAD阵列已越来越多地应用于PoC设备中，用于基于荧光的检测[13,14]，但其在吸光度测量中的应用尚未得到探索。与从稳态强度估计吸光度的传统光度系统不同，所提出的方法利用基于检测到的光子时间分布的测量原理。在这种情况下，时间参数（τ）代表从光子到达直方图中得出的衰减常数。重要的是要区分这种时间分辨指标（它源自传感器处光子检测的随机统计）和荧光寿命（某些分析物的分子属性）。这种时间分辨策略允许在强度检测仪饱和的情况下进行量化，从而无需光学衰减或样本连续稀释即可扩展检测动态范围。最近的研究表明，分析SPAD传感器中的光子到达分布可以获取超出饱和状态的有意义信息[15,16]。利用时间分辨测量，这里训练了一个卷积神经网络（CNN）直接从16-bin直方图数据中推断分析物浓度。虽然这种方法通过消除每次检测所需的校准曲线简化了分析工作流程，但训练过程本身是一种隐式的校准形式。因此，模型的准确性取决于训练数据的质量，必须考虑矩阵效应和批次间的变异性以及仪器因素，如光源强度波动或热噪声。在学习阶段，这些因素被内化以确保在不同实验条件下的稳健推断。
尽管这种时间分辨方法有潜力应用于广泛的显色剂，但在这里我们检测了HRP/TMB酶系统。为此，我们使用了一种基于磁颗粒的免疫测定（MP-Immunoassay）作为模型，该测定针对B型流感核蛋白。呼吸道感染是一个重要的全球健康问题，流感是最常见的病毒性病原体之一。这些感染尤其影响儿童、老年人以及有基础健康问题的个体，常常导致严重的并发症和住院[17]。尽管A型流感由于其大流行潜力而受到更多关注，但根据过去十年的全球监测数据和2025年的临床报告，B型流感约占季节性病例的20-30%[18,20]。此外，它可能导致具有类似症状和严重性的疫情，并与大量的儿童住院和死亡相关[[21], [22], [23]]。由于其症状与其他呼吸道病毒重叠，早期和准确的检测对于指导临床决策、防止不必要的抗生素使用以及及时干预至关重要。在这个框架下，所提出的基于SPAD的读数仪提供了一个理想的测试平台，用于评估基于寿命的吸光度测量与成熟的光度测量方法的性能。从分析角度来看，我们的目标是证明这种时间分辨SPAD读数是一种可行的策略，可以扩展动态范围并改善比色HRP/TMB免疫测定的关键性能指标（LoD、LoQ和重复性），而无需引入额外的稀释步骤。
本文的结构如下：第2节详细介绍了基于SPAD的芯片架构、工作原理和PoC硬件实现。第3节展示了与商用仪器的实验评估和基准测试，包括在直方图数据上训练的神经网络的性能。最后，第4节提供了结论，强调了所提出的PoC平台的优势和局限性及其在未来的诊断应用中的潜力。
带有像素内直方图的SPAD相机
SPAD相机采用180 nm高压（HV）CMOS工艺制造。它集成了一个12 × 16的SPAD像素阵列，其在2.3 V过电压下的暗计数率（即传感器的固有热噪声）低于10 kHz，在90%的测量设备中表现出均匀的性能。图1a显示了带有主要电路块的芯片显微图。像素设计包括16-bin模拟存储器和用于光子事件的本地电路。
结果与讨论
通过检测针对pInfB的MP-Immunoassay来评估基于SPAD的PoC平台的性能（图1d）。在这种测定中，一对单克隆抗体在MP表面捕获了逐渐增加的pInfB浓度，并将其连接到酶标签Poly-HRP上。检测包括添加TMB/H2O2酶底物溶液，该溶液产生的二亚胺显色剂与结合的Poly-HRP（从而也是样本中的pInfB）的浓度成正比。
结论
这项工作展示了一种基于带有像素内模拟直方图的SPAD阵列的便携式比色读数仪，能够通过时间分辨光子统计来量化吸光度。该平台利用光子到达衰减常数（τ）来克服传统光度系统固有的饱和限制，从而无需光学衰减或稀释步骤即可直接估计吸光度。
基于τ的方法实现了0.0034 ng/mL^-1的检测限（LoD）和...
CRediT作者贡献声明
S. Moreno：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究，数据管理。
O. Caravaca-Müller：软件。
X. García-Fernández：撰写 – 审稿与编辑，资源管理，研究。
M.B. Jaballah：撰写 – 审稿与编辑，资源管理，研究。
A. Vilà：撰写 – 审稿与编辑，数据管理，概念化。
E. Baldrich：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，资金获取，概念化。
A. Diéguez：撰写 –
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在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT/Gemini来改进语言、可读性并编辑手稿文本。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了以下资助：PID2019-105714RB-I00、PID2022-136833OB-C21、PDC2023-145805-I00和PID2023-148950OB-C22，由MICIU/AEI/10.13039/501100011033以及欧洲区域发展基金和欧盟NextGenerationEU/PRTR资助。作者感谢Diagnostic Nanotools（2021SGR00617）和SIC（Sistemes d’Instrumentació i Comunicacions）（2021-SGR1108）的支持，这两个组织得到了大学和研究部（Generalitat）的认可。
