《Synthetic and Systems Biotechnology》：Metabolic modulation of TCA cycle by
S-nitrosylation in
Monascus spp.
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本研究聚焦于S-亚硝基化(S-nitrosylation)在红曲霉菌(Monascus spp.)代谢调控中的作用。为解决氮源如何通过蛋白质翻译后修饰影响红曲霉菌生长及莫纳可林K(Monacolin K)、红曲色素等有益次级代谢物合成的机制问题，研究人员开展了S-亚硝基化蛋白质组学与代谢组学分析。结果表明，不同氮源可诱导广泛且特异的S-亚硝基化修饰，其中87%的三羧酸(TCA)循环关键酶被修饰，显著抑制了TCA循环代谢流，从而负向调控次级代谢物的合成。该研究首次在红曲霉菌中系统揭示了S-亚硝基化作为关键代谢调控开关的角色，为通过代谢工程手段提高高附加值代谢物产量提供了新策略。
在传统食品与医药领域闪耀了千年的红曲霉菌，不仅是酿造红曲米、制作腐乳的“魔法师”，更是生产具有降胆固醇功能的莫纳可林K(Monacolin K)和天然食用色素——红曲色素(Monascus pigments)的“细胞工厂”。这些有益的次级代谢物(Secondary Metabolites, SMs)使其在医药和食品工业中拥有广泛应用。然而，如何高效、可控地让这个“细胞工厂”生产更多我们需要的“产品”，一直是科研人员努力的方向。人们早已知道，营养、基因和环境等诸多因素共同影响着红曲霉菌的生长与代谢，其中氮源是关键调控因子之一。例如，无机氮源硫酸铵会抑制色素合成，而适量硝酸钠能促进莫纳可林K产生，过高浓度则产生毒性。氮源不仅是营养，其衍生的信号分子一氧化氮(NO)还能通过一种名为S-亚硝基化(S-nitrosylation)的蛋白质翻译后修饰(Post-Translational Modification, PTM)，像一把“分子钥匙”一样改变蛋白质的结构与功能，从而调控代谢。但长期以来，氮源如何通过S-亚硝基化这把“钥匙”在红曲霉菌内部“开锁”，精准调控包括三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循环在内的核心代谢通路，进而影响次级代谢物合成的具体机制，仍是一个未被探索的“黑箱”。
为了揭开这个“黑箱”的秘密，来自华中农业大学的研究团队孟梓桐、谭映傲、段亚丽和李牧在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了一项研究。他们综合运用了多种前沿技术手段，系统解析了不同氮源条件下S-亚硝基化修饰图谱，并将其与红曲霉菌的代谢表型精准关联，首次揭示了S-亚硝基化作为核心调控开关，通过全面抑制TCA循环来调控红曲霉菌生长与代谢的全新机制。这项研究不仅深化了对真菌代谢调控网络的理解，也为通过精准操控翻译后修饰来定向优化工业菌株、提高目标产物产量提供了创新的理论依据和潜在靶点。
为开展此项研究，作者主要运用了几个关键技术方法：首先，使用碘化串联质谱标签(Iodo-TMT)标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，对红曲霉紫色菌株(M. purpureus)HJ11（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 25474）在不同氮源（硫酸铵、硝酸钠、L-精氨酸）处理下的蛋白质进行了位点特异性的S-亚硝基化蛋白质组学定量分析。其次，利用基于质谱的靶向代谢组学技术，同步分析了菌体生物量、莫纳可林K、红曲色素以及包括氨基酸、TCA循环中间体在内的关键代谢物的含量。最后，通过生物信息学方法（如蛋白互作网络、KEGG通路富集分析）对修饰蛋白进行功能注释和关联分析，并选取关键酶在体外用S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)诱导修饰，验证了S-亚硝基化对酶活性的直接影响。
3.1. 位点特异性S-亚硝基化蛋白质组学鉴定
研究人员采用Iodo-TMT标记技术，成功在M. purpureus HJ11中鉴定出352个S-亚硝基化蛋白，包含505个独特的半胱氨酸修饰位点，首次绘制了红曲霉菌的S-亚硝基化蛋白质组全景图。质谱数据质量高，误差分布集中，为后续分析奠定了可靠基础。
3.2. S-亚硝基化蛋白的分布模式
不同氮源诱导的S-亚硝基化修饰位点存在显著差异，其中L-精氨酸(Arg)处理诱导的修饰范围最广。功能分析表明，这些差异修饰蛋白广泛分布于糖酵解/糖异生、TCA循环、核糖体、氨基酸代谢和脂肪酸代谢等关键通路中，且主要定位于细胞质、线粒体和细胞核。
3.3. S-亚硝基化调控氨基酸与能量代谢
通过构建蛋白互作网络并筛选核心靶基因，研究发现S-亚硝基化修饰主要影响氨基酸代谢和能量代谢（糖酵解/糖异生、TCA循环）相关蛋白，表明氮源诱导的S-亚硝基化很可能是通过调控这些核心代谢通路来影响红曲霉菌的生理过程。
3.4. S-亚硝基化与代谢表征的关联
代谢表型分析显示，不同氮源显著改变了红曲霉菌的代谢模式。使用硫酸铵时，菌体生物量和色素产量最高，且促进了TCA循环中间产物的积累；而使用L-精氨酸则得到相反结果。相关性网络分析进一步揭示，与糖酵解/糖异生相关的代谢物与一组S-亚硝基化蛋白呈正相关，而与TCA循环相关的代谢物则呈负相关。
3.5. S-亚硝基化对TCA循环的代谢调控
研究发现了最关键的证据：TCA循环中高达87%的酶都被广泛地S-亚硝基化修饰。多个酶拥有多个修饰位点。与硫酸铵相比，L-精氨酸处理导致了更高水平的S-亚硝基化，但TCA循环关键中间代谢物（如柠檬酸、苹果酸等）的含量却更低。为验证修饰的功能，研究选取了TCA循环的关键酶异柠檬酸脱氢酶(IDH)和糖酵解关键酶丙酮酸激酶(PK)进行体外实验。结果显示，经GSNO诱导S-亚硝基化后，这两种酶的活性均被显著抑制。
结论与意义
该研究系统阐明了S-亚硝基化是不同氮源调控红曲霉菌TCA循环，进而差异化影响其生长和代谢的关键机制。主要结论包括：第一，研究首次提供了红曲霉菌位点特异性的S-亚硝基化蛋白质组数据集。第二，研究首次证明S-亚硝基化是一个关键的分子开关，通过修饰TCA循环中87%的酶，全面抑制了该循环的代谢流。这种抑制减少了用于合成莫纳可林K和红曲色素的前体物质和能量供应，从而降低了这些高附加值次级代谢物的产量。第三，研究揭示了氮源通过调节蛋白质S-亚硝基化水平来重编程初级代谢和次级代谢物合成的新机制。
这项研究的科学意义重大。它将环境信号（氮源）、蛋白质翻译后修饰（S-亚硝基化）、核心代谢通路（TCA循环）和最终经济性状（次级代谢物产量）串联成一个清晰的调控链条。这不仅为理解真菌乃至更广泛生物体系的代谢调控提供了新视角，也开辟了新的代谢工程策略：未来或可通过基因编辑手段，精确改变TCA循环关键酶上特定半胱氨酸位点，使其免于S-亚硝基化抑制，从而在特定氮源条件下“解锁”TCA循环的流量，定向高效地提升目标代谢物的工业产量。因此，该研究是连接基础生物学发现与工业生物技术应用的一个重要桥梁。
