《Tissue and Cell》：Therapeutic efficacy of L-citrulline versus L-citrulline hydrogel in testicular ischemia/reperfusion injury: Modulation of the SIRT-1/NF-κB and NO synthesis (eNOS/iNOS) pathways
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本研究比较了游离L-柠檬酸及其水凝胶制剂在预防大鼠睾丸扭转/松解缺血再灌注损伤中的作用，发现水凝胶能更有效减轻氧化应激、抑制炎症和凋亡，通过激活SIRT1信号通路保护睾丸功能及结构。
Eman M. Embaby|Aya Megahed|Aya Aly Elzeer|Sally Abdallah Mostafa|Alaa Samy|Amgad E. Salem|Hussein Abdellatif|Eman E. Elwakeel|Mamdouh Eldesoqui
埃及曼苏拉大学兽医学院生理学系，曼苏拉35516
摘要
背景
睾丸扭转是一种泌尿系统急症，会中断血液流动，导致缺血/再灌注损伤（I/R I），从而损害睾丸的功能和结构。L-瓜氨酸（L-Cit）是一种具有抗氧化能力的一氧化氮前体，已被证明有助于减轻睾丸损伤。本研究旨在通过比较游离L-Cit与其水凝胶制剂在睾丸扭转/复位（T/TD）损伤大鼠模型中的即时和有效抗缺血效果，提供新的见解。
材料与方法
35只成年雄性Wistar白化大鼠被随机分为五个相等大小的组（每组7只）：正常对照组、假手术组、T I/R I组、T I/R I + L-Cit组和T I/R I + L-Cit纳米制剂组（NL-Cit组）。通过将左侧睾丸旋转720°持续3小时来诱导睾丸扭转，随后进行复位。在复位前1小时，以600毫克/千克体重的剂量给予治疗。在再灌注7天后，通过生殖激素水平、氧化应激和炎症标志物、凋亡参数以及组织学和免疫组织化学分析来评估生殖功能和睾丸完整性。
结果与讨论
结果显示，L-Cit及其水凝胶形式均显著改善了T/TD引起的损伤，表现为生殖激素血清浓度升高（p < 0.05）。TAC、GPx、CAT和SOD活性升高，MDA和NO浓度降低，表明氧化应激减轻。睾丸中的TNF-α、IL-1β、caspase-3、BAX、eNOS和NF-κB p65水平显著降低，而SIRT-1显著升高。组织病理学检查显示睾丸损伤最小，纤维化情况也证实了L-Cit的保护作用。值得注意的是，L-Cit水凝胶表现出更优的效果，这可能是由于其缓释性和增强的局部生物利用度。
结论
L-Cit载入的水凝胶可能是一种潜在的治疗策略，可用于保护T/TD损伤后的睾丸功能，效果优于游离L-Cit。L-Cit可能通过激活SIRT-1来预防手术过程中的T I/R I引起的氧化应激和炎症，通过激活eNOS促进NO合成，并在再灌注阶段中和iNOS的产生和致病性NO水平。这些机制可能增强了L-Cit在手术过程中保护睾丸的潜力。
引言
睾丸扭转是一种泌尿系统急症，由精索扭转引起，导致血液流动受阻、动脉阻塞、缺血和生殖腺坏死（Fernández-Pascual等人，2022年；Kim等人，2022年）。立即诊断和干预至关重要，因为扭转时间超过六小时的睾丸被认为已超出存活阈值（Mellick等人，2019年）。传统的治疗方法是手术干预，通过反向旋转睾丸来纠正扭转，但这可能会导致随后几年男性不育，因为再灌注会增加睾丸的氧化应激，损害精子生成，并导致大量生殖细胞死亡（Qiao等人，2017年）。
缺血/再灌注损伤（I/R I）的主要特征是自由基的过度产生。在缺血阶段，血液流动受到限制，而在再灌注阶段，氧气进入组织，导致活性氧（ROS）的过度生成和受影响细胞中抗氧化剂的消耗（Chen和Li，2020年；Goncharov和Sharapov，2023年）。这些ROS引起的氧化应激可导致器官功能障碍、DNA损伤和局部炎症反应。这种炎症和氧化应激的结合会引发细胞因子风暴，最终导致细胞损伤和死亡（Wu等人，2020年；Güler等人，2022年）。中性粒细胞在扭转引起的急性缺血后通过释放关键促炎细胞因子（Khanzadeh等人，2022年），包括IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α（Güler等人，2021年），维持炎症环境。这种缺血损伤还会引发全身性应激反应，表现为内源性皮质醇水平升高，进而导致淋巴细胞计数下降（Nissen等人，2021年）。附件扭转患者的中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）显著高于其他附件肿块患者，表明NLR在区分扭转与其他附件病变方面具有重要的诊断价值（Khanzadeh等人，2022年）。同样，睾丸癌患者的NLR也显著高于健康对照组和良性睾丸病变患者，并在睾丸切除术后显著降低（Sarejloo等人，2024年）。从临床角度来看，寻找可用作手术修复辅助治疗的实验药物至关重要。目标是尽快防止睾丸发生I/R I。
L-瓜氨酸（L-Cit）是一种天然存在的非必需氨基酸，在哺乳动物体内存在，但在生理压力和疾病状态下会变得条件必需（Chowdhury，2023年）。L-Cit是在精氨酸（Arg）转化为一氧化氮（NO）的过程中产生的副产品。此外，L-Cit可以再循环为Arg，从而维持足够的Arg水平以供NO生成（Tovar-Villegas等人，2024年）。口服L-Cit可提高血浆Arg浓度，并以剂量依赖的方式增强NO依赖性信号传导。L-Cit相对于L-Arg的一个关键优势是它绕过了肝脏代谢过程，不是精氨酸酶的底物，因此可以高效利用（Gonzalez等人，2023年；Uyanga等人，2023年）。先前的研究表明，L-Cit补充剂能有效减轻I/R I引起的胃、肾、心肌和睾丸损伤。这种效果与其维持持续NO合酶活性的机制有关（Yi等人，2012年；Fu等人，2013年；Baumgardt等人，2016年；Embaby等人，2025年）。
由于L-Cit是一种亲水性药物，其有效给药需要克服快速酶降解和清除的问题，这些问题限制了其在循环中的分布和达到有效治疗水平的效率（Maurya等人，2024年）。这突显了需要一种药物递送系统来提高其治疗效果。水凝胶就是这样一种系统，它可以通过将亲水性药物结合到Poloxamer 407水凝胶中来增强药物递送，Poloxamer 407水凝胶因其低毒性和弱免疫原性而常被使用（Alaghawani等人，2024年）。这种类型的水凝胶特别有用，因为它在室温下为液体，但在体温下变为凝胶（Yu等人，2021年），从而实现L-Cit的局部和持续释放。因此，我们假设从Poloxamer 407水凝胶中缓慢或可控地释放L-Cit将增强睾丸修复效果，并在单次给药后提供持久的治疗效果。
本研究调查了L-Cit及其水凝胶制剂在恢复大鼠模型缺血-再灌注损伤后的睾丸功能和结构方面的治疗潜力。具体而言，重点关注L-Cit减轻氧化应激、抑制炎症级联反应、调节凋亡和激活SIRT1信号传导的能力，从而评估其作为缺血性睾丸损伤靶向治疗策略的转化潜力。
含L-Cit的Poloxamer基凝胶的制备与评估
使用冷法制备了含有20% w/w P407的Poloxamer水凝胶制剂（Schmolka，1972年）。简要来说，将P407分散在去离子水中（DW），然后将混合物冷却至5°C，并定期搅拌以确保完全溶解，直至获得清澈均匀的溶液（Haggag等人，2022年）。随后，通过以500 rpm的速度磁力搅拌，将L-Cit以10%（w/w）的浓度加入制备好的水凝胶中。
L-瓜氨酸水凝胶的尺寸分析和TEM分析
PS和PDI的结果表明，该水凝胶由均匀的纳米级颗粒组成。平均PS（z-平均）为33.4 ± 0.12 nm，PDI为0.32 ± 0.01，证实了水凝胶的纳米级特性和狭窄的尺寸分布。这表明水凝胶颗粒大小一致，这是药物递送和生物医学领域所期望的特性。
PS和PDI的分析结果通过其他技术得到了验证。图2中的TEM图像也证实了这一点。
讨论
睾丸扭转是由精索扭转引起的泌尿系统急症，需要及时手术干预以防止组织损伤和保持生育能力（Laher等人，2020年）。尽管进行了复位，但由于I/R I，仍可能发生睾丸萎缩和精子生成受损（Jacobsen等人，2020年；Alawamlh等人，2021年），这突显了改进疗法的必要性。虽然一些药物显示出保护作用，但临床上可行的选择仍然有限。L-Cit具有
结论
通过评估功能和结构结果，本研究为优化睾丸保护和生育能力保存的抗氧化策略提供了重要见解。研究发现，L-Cit通过减轻氧化应激、抑制凋亡和激素紊乱有效减轻了TD引起的睾丸损伤，其中L-Cit水凝胶制剂的保护效果最为显著。水凝胶在I/R后增强了睾丸再生
局限性
虽然Wistar白化大鼠为研究缺血-再灌注（I/R）损伤提供了可控的模型，但啮齿动物与人类之间的生理和药代动力学差异可能限制了L-Cit水凝胶的临床应用。一个显著的局限性是L-Cit是作为预处理剂给予的；而在临床情况下，通常已经发生了严重的缺血。此外，由于本研究仅使用了单次口服剂量，
建议
我们推测再灌注后可能会存在一定程度的不可逆损伤，这强调了及时干预的重要性以及可能需要联合疗法来实现完全的睾丸恢复。此外，目前的发现仅强调了进一步研究L-Cit水凝胶在睾丸保护中的潜在用途的必要性。未来的研究应包括不同的剂量、多种给药途径和纵向研究
CRediT作者贡献声明
Aya Aly Elzeer：撰写原始草稿、验证、软件使用、实验设计、数据分析。Sally Abdallah Mostafa：撰写原始草稿、软件使用、方法学设计、实验设计、数据管理。Eman M. Embaby：审阅和编辑、数据可视化、验证、软件使用、项目管理、方法学设计、实验设计、数据管理、概念构思。Aya Megahed：撰写原始草稿、数据可视化、验证、项目管理、方法学设计、实验设计、数据管理
致谢
作者衷心感谢沙特阿拉伯利雅得AlMaarefa大学支持该项目（项目编号MHIRSP2025040）的研究人员对本研究的支持。
披露
作者没有需要披露的利益冲突。
研究诚信
本研究遵循伦理标准和动物研究指南进行。曼苏拉大学审查委员会批准了所有涉及动物的程序。
数据和发现
本手稿中呈现的发现是原创的，尚未在其他地方发表。
