《Tissue and Cell》：Protective effects of multivitamins compared to vitamin E against low-dose methotrexate-induced testicular injury in rats: Histological, immunohistochemical, and morphometric study
编辑推荐：
抗氧化剂对甲氨蝶呤诱导睾丸损伤的保护作用及多维生素与单维生素疗效比较
Rasha A. Elsisy | Mariam R. Nofal | Manal E. El-Sawaf | Mamdouh Eldesoqui | Noha H. Sakr
卡夫雷尔谢赫大学医学院解剖学系，埃及卡夫雷尔谢赫33516
摘要
背景
甲氨蝶呤（MTX）是治疗癌症和慢性炎症性疾病（如类风湿性关节炎）的基本药物，通常采用长期低剂量疗法。然而，长期低剂量使用MTX往往会受到累积性生殖毒性的限制，这种毒性主要由氧化应激引起。虽然像维生素E这样的单一抗氧化剂已被广泛研究，但综合多种维生素制剂（如Centrum）的协同保护作用仍不够明确。本研究旨在评估和比较单一抗氧化剂（维生素E）与复合维生素制剂（Centrum）对MTX引起的睾丸损伤的保护效果。
方法
将30只健康的成年雄性白化大鼠分为六组：对照组（ctrl）、Centrum组（CE）、维生素E组（VE）、甲氨蝶呤组（MTX）、Centrum+甲氨蝶呤组（CE+MTX）以及维生素E+甲氨蝶呤组（VE+MTX）。四周后，检测了丙二醛（MDA）这一氧化应激标志物、超氧化物歧化酶（SOD）这一抗氧化标志物，以及白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）等炎症标志物。同时对睾丸组织进行了组织病理学检查，包括H&E染色、电子显微镜（EM）观察以及caspase-3的免疫组化染色，并进行了形态计量分析。
结果
在甲氨蝶呤组中，通过光学显微镜观察到空泡形成、细胞脱离和透明质沉积；通过电子显微镜观察到细胞溶解和线粒体损伤；SOD水平降低，MDA和IL-1β、IL-6水平升高，caspase-3染色面积百分比增加。经过治疗的各组在组织学、生化和形态计量学方面均有显著改善，其中Centrum组的改善效果优于维生素E组。
结论
复合维生素制剂（Centrum）在减轻低剂量甲氨蝶呤引起的睾丸损伤方面比单一维生素（维生素E）具有更显著的效果。
引言
工业化学品、药品、农业化学品以及其他环境毒素已被证实是能够损害睾丸功能的强效生殖毒素（Li和Spade，2021）。此外，男性生殖系统容易受到电磁场（EMF）的影响。长期暴露于来自电力分配线和电气系统的电磁场会导致严重的睾丸病理变化和细胞损伤（Gazwi等人，2020）。尽管存在这些环境因素，化疗仍然是导致睾丸损伤的主要原因之一，常常导致暂时性或永久性不育（Ismail等人，2023）。
抗叶酸药物甲氨蝶呤（MTX）被广泛用于治疗多种炎症性和自身免疫性疾病，如克罗恩病、类风湿性关节炎（RA）和银屑病，需要终身监测和治疗。它通常以低剂量使用，显著改变了RA的治疗方式（Belhan等人，2019；Bafna等人，2021；Ibfelt等人，2021）。然而，长期使用MTX会对生殖系统（Aldhahrani等人，2021）、神经系统（Shao等人，2019）、肝脏（Al-Kuraishy等人，2023；Hasan Khudhair等人，2022）和肾脏（Heidari等人，2018）造成有害影响。在男性生殖系统中，MTX会导致精子浓度和活力下降（少精症和弱精症），以及生精小管直径和生殖上皮厚度减小（Aldhahrani等人，2021）。长期低剂量使用MTX还会在精子发生过程中引起睾丸损伤（Saxena等人，2004）。
MTX引起组织损伤的主要机制是诱导氧化应激（Hasan Khudhair等人，2022）。由于睾丸细胞膜中含有高浓度的多不饱和脂肪酸，因此睾丸特别容易受到这种氧化损伤（Heidari等人，2025）。MTX通过降低NADPH的可用性和耗尽谷胱甘肽池来破坏抗氧化防御系统，导致活性氧（ROS）的积累和随后的DNA氧化损伤（Sherif等人，2020）。这种损伤激活p53信号通路，上调促凋亡因子，从而引发生殖细胞的程序性死亡。此外，MTX还会加剧炎症反应并干扰DNA合成，进而破坏能量代谢和细胞周期进程（Zarei和Shahrooz，2019）。因此，保护生育能力和减轻接受MTX治疗患者的睾丸损伤具有重要的临床意义。
在活体组织中，维生素E（α-生育酚）是一种脂溶性抗氧化剂，可保护细胞膜免受脂质过氧化和氧化降解。它能有效调节活性氧（ROS）的产生并调节细胞内信号转导（Lee和Han，2018）。维生素E还能提高精子的质量和数量，并对哺乳动物的精子发生过程至关重要。由于其抗氧化作用，它还能保护精子和睾丸免受其他化学物质的有害影响（Yousefi等人，2025）。
在美国，最受欢迎的膳食补充剂是复合维生素-矿物质（MVM）制剂，如Centrum。许多美国人使用MVM来维护整体健康或降低患慢性疾病的风险（Du等人，2020；Baker等人，2023）。Centrum含有近26种维生素和矿物质，包括维生素A、C、K、D、E、B2、B1、B9、B5、B7、B3、B12、硫酸锌、氯化钙、硫酸硒、硫酸镁等，因此是一种复合抗氧化剂的来源（Alahmar和Singh，2022；De Aguiar等人，2023）。
由于目前针对MTX副作用的治疗选择有限，因此需要进一步研究Centrum和维生素E补充剂在对抗睾丸毒性方面的效果及其最佳使用方法。值得注意的是，此前尚未进行过单一抗氧化剂（维生素E）与复合维生素制剂（Centrum）之间的效果比较研究。因此，本研究旨在比较维生素E与复合维生素（Centrum）在减轻低剂量MTX引起的睾丸损伤方面的效果，重点关注组织病理学变化以及炎症和氧化应激生物标志物的调节作用。
伦理批准
所有动物实验均遵循ARRIVE指南，并符合英国《动物（科学程序）法案》（1986年）及相关指南，以及欧盟关于动物实验的指令2010/63/EU。所有实验程序和技术均在卡夫雷尔谢赫大学药学院的动物房进行，符合实验室动物护理和使用指南以及伦理委员会的批准。
治疗对氧化应激标志物的影响
MTX的使用显著破坏了睾丸的氧化还原平衡，表现为MDA水平显著升高，SOD活性相应降低。虽然Centrum和维生素E补充剂有效缓解了这些变化，降低了MDA水平并恢复了SOD活性，但其水平仍与对照组存在显著差异。特别是Centrum+MTX组的抗氧化效果更优。
讨论
甲氨蝶呤（MTX）是一种广泛用于治疗恶性及非恶性疾病的化疗药物，包括炎症性疾病。它对具有高增殖能力的生殖细胞具有毒性，导致精子发生细胞损伤，从而引起不育（Delen和Uz，2021）。低剂量MTX常用于长期治疗免疫介导的炎症性疾病，如类风湿性关节炎（Yan等人，2022）。
维生素E在...
结论
本研究表明，低剂量甲氨蝶呤（MTX）使用会导致显著的睾丸损伤，表现为氧化应激、持续炎症和Caspase-3介导的细胞凋亡。维生素E和Centrum的补充均显著缓解了这些退行性变化，但Centrum的细胞保护作用优于维生素E。临床医生应密切监测接受长期MTX治疗的男性患者的睾丸状况。
研究的局限性
尽管本研究取得了重要发现，但仍存在一些局限性。本研究使用的是大鼠模型，因此在将这些发现应用于人类临床实践时需谨慎考虑物种间的生理差异。此外，我们的四周实验周期仅模拟了短期累积毒性，而类风湿性关节炎等慢性疾病患者的实际治疗时间通常长达数年。
贡献
所有作者都对研究的构思、设计、执行和解释做出了重要贡献。我们共同审阅并批准了最终稿件。
我们感谢有机会将我们的研究成果提交给《Tissue and Cell》期刊。
研究诚信
本研究遵循伦理标准和动物研究指南。Mansoura大学的审查委员会批准了所有涉及动物的实验程序。
数据和发现
本手稿中的发现是原创的，未在其他地方发表。我们确认所有数据准确无误，结果解释基于可靠的科学原理。
CRediT作者贡献声明
Noha H. Sakr：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、数据可视化、验证、软件使用、项目管理、方法论设计、实验设计、数据分析、概念化。
El-sawaf Manal E.：撰写——审阅与编辑、验证、监督、项目管理、方法论设计、实验设计、数据分析、概念化。
Mamdouh Eldesoqui：撰写——审阅与编辑、验证、软件使用、资金筹集、数据管理。
Rasha A. Elsisy：...
伦理声明
根据ARRIVE指南，本研究获得了卡夫雷尔谢赫大学动物伦理委员会的批准。委员会颁发了伦理许可KFS-IACUC/125/2023。研究遵循了所有适用的法规和机构指南。
资金
本研究未接受任何其他来源的资助。
利益冲突声明
作者声明与本研究无关的利益冲突。
