《European Journal of Human Genetics》：Tumor patterns and cancer risk in carriers of TP53 exonic germline variants that alter mRNA splicing
编辑推荐：
为了阐明RNA剪接异常在Li-Fraumeni综合征（LFS）致病性中未被充分认识的作用，研究人员整合SpliceAI预测、体外小基因报告系统（minigene）和TCGA肿瘤RNA测序分析，对导致错义或同义变化的TP53外显子单核苷酸变异（SE-SNVs）进行了系统性评估。研究发现，这些先前依据蛋白功能被视为轻度或低致病性的变异，可因剪接破坏导致更早的肿瘤发生和典型的LFS谱系癌症，表明剪接效应可超越氨基酸改变的影响。该研究为TP53变异的精准解读和LFS风险分层提供了关键证据。
在癌症遗传学领域，Li-Fraumeni综合征（Li–Fraumeni syndrome, LFS）是一种由TP53基因胚系致病性变异引起的、具有高度异质性的常染色体显性遗传性癌症易感综合征。患者一生中罹患多种癌症的风险显著增高，尤其在儿童期、青少年期和成年期表现出特定的发病高峰，肿瘤谱复杂，给个体及家族层面的精准预测带来巨大挑战。传统上，对TP53基因变异的解读和致病性分类主要依赖于其编码的p53蛋白的结构改变和功能丧失程度。然而，一个日益凸显却常被低估的问题是：许多发生在基因编码区（外显子）的单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs），除了可能改变氨基酸序列（错义变异）或维持不变（同义变异）外，还可能通过影响前体信使RNA（pre-mRNA）的剪接过程，即产生“剪接致病性”（spliceogenic）效应，从而导致基因功能的丧失。这种由剪接异常驱动的致病机制，可能会完全覆盖或显著改变仅基于蛋白质水平评估所得出的风险预测，使得一部分实际具有高风险的变异被错误地归类为“良性”或“意义不明确”，进而影响携带者的临床监测和管理决策。
为了深入探究这一问题，并系统评估剪接致病性外显子SNVs（spliceogenic exonic SNVs, SE-SNVs）在TP53相关癌症易感性中的真实贡献，一个国际研究团队开展了一项综合性研究。他们旨在回答：TP53基因中存在多少这样的SE-SNVs？它们如何干扰正常的RNA剪接？携带这些变异的个体，其癌症发病年龄和肿瘤类型是否比仅基于其氨基酸改变所预测的更为严重？这项研究的结果发表于《European Journal of Human Genetics》期刊，为理解TP53变异的完整致病机制和优化LFS的风险评估提供了重要新视角。
研究人员采用了一套多层次的技术方法体系来系统性地解答上述问题。首先，他们利用基于深度神经网络的剪接预测工具SpliceAI，对TP53所有外显子区域可能的单核苷酸替换进行扫描，以delta分数≥0.4为阈值，初步筛选出潜在的剪接致病性变异（SE-SNVs）。接着，为了验证预测的可靠性，他们构建了基于pSPL3载体的体外小基因报告系统（minigene assay），在COS1细胞中对筛选出的高评分候选变异进行功能实验，直接观察其是否引起异常剪接事件（如外显子跳跃、内含子保留）。同时，为了获得体内证据，他们分析了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）计划的肿瘤RNA测序数据，在真实的癌症样本中追溯SE-SNVs相关的剪接模式。最后，为了建立基因型与临床表型之间的关联，研究团队整合了来自国际癌症研究机构/美国国家癌症研究所（IARC/NCI）TP53数据库、法国和德国LFS临床登记处以及系统性文献回顾的临床数据，构建了一个包含不同类别TP53变异携带者的队列，比较了SE-SNVs携带者与非SE-SNVs携带者在首次癌症诊断年龄、癌症累积发病率和肿瘤谱方面的差异。
结果
TP53 SNVs的SpliceAI预测
研究利用SpliceAI工具对TP53外显子（2-11号）的所有单核苷酸替换进行了剪接影响预测。以delta分数≥0.4为界，共鉴定出58个潜在的剪接致病性外显子SNV（SE-SNVs），其中40个为错义变异，18个为同义变异。这些变异在体细胞（如COSMIC数据库）和胚系（如IARC/NCI数据库）TP53变异数据集中有重叠但分布受限，在胚系数据中尤为集中，如同义变异c.375 G>A (p.(Thr125=))在胚系数据中占比高达38%。值得注意的是，绝大多数（91.4%）预测的SE-SNVs落在了依据酵母反式激活实验定义的、功能受损较轻微或接近野生型的C类和D类错义变异中，而在功能严重受损的A类和B类变异中仅占少数。进一步分析发现，在C类和D类变异中，SpliceAI预测的剪接致病性分数与另一项基于CRISPR-Cas9的饱和突变筛选所测得的相对适应度分数（relative fitness score, rfs）呈正相关，尤其是在D类变异中相关性显著。这提示，许多基于蛋白功能被归类为衰减型或良性的C/D类变异，可能通过剪接破坏机制产生致病效应，从而覆盖了其氨基酸替换的影响。
SE-SNVs的功能分析
为了验证SpliceAI的预测，研究团队对17个高分SE-SNVs（包括C/D类错义变异和高分同义变异）进行了体外小基因报告系统验证。结果显示，其中15个（88%）确实导致了异常的剪接模式，主要包括隐匿剪接位点激活引起的部分外显子跳跃或内含子序列的异常保留，这些改变通常会导致阅读框移位和提前终止密码子的产生，从而可能引发无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）。有2个变异在本次实验体系中未显示异常剪接。特别的，变异c.551 A>G (p.(Asp184Gly))导致外显子5末端发生框内三核苷酸缺失，但保留了部分正常剪接。对TCGA肿瘤RNA测序数据的分析进一步在体内证实了这些SE-SNVs的剪接致病效应，结果与小基因实验结果高度一致。与另一项类似研究（Fortuno等，2025）的比较显示总体吻合，但也存在因细胞模型（COS1 vs. SK-BR-3）和实验设计差异导致的个别不一致，凸显了剪接调控的细胞背景依赖性。
基因型-表型关联
临床表型分析是本研究的关键。研究人员整合了多源数据，比较了携带SE-SNVs（且原被归为C/D类）的个体与其他类别TP53变异携带者的癌症风险。结果发现：
- 1.
发病年龄更早：携带C/D类SE-SNVs的个体，其中位首次癌症诊断年龄约为27岁，这与携带经典高风险A类变异（28岁）或内含子剪接位点致病变异（30岁）的携带者相似。相比之下，携带非SE-SNVs的C/D类变异个体的中位诊断年龄则显著更晚（≥40岁）。
- 2.
肿瘤谱符合LFS特征：这些SE-SNVs携带者所患癌症包括儿童肾上腺皮质癌、青少年骨肉瘤和星形细胞瘤、早发性乳腺癌等，均为典型的LFS谱系肿瘤。
- 3.
变异c.375 G>A (p.(Thr125=))的特殊性：作为胚系数据中最常见的SE-SNV，其携带者表现出较宽的疾病严重度谱，发病年龄呈双峰分布（既有儿童/青少年发病，也有成年发病），中位诊断年龄（38岁）介于B类和C类变异携带者之间，表明其剪接破坏可能是不完全且可变的。
这些数据强有力地表明，对于C/D类SE-SNVs，剪接破坏效应能够覆盖其相对温和的氨基酸替换效应，导致比预期更为严重的临床表型。
结论与讨论
本研究通过整合生物信息学预测、功能性剪接验证和临床基因型-表型关联分析，首次系统性地揭示了TP53外显子单核苷酸变异中剪接致病性（spliceogenicity）的广泛存在及其重要的临床意义。
核心结论指出，一部分先前仅基于蛋白质结构和功能分析被归类为良性或低危的TP53错义及同义变异，实质上是潜在的剪接致病性变异（SE-SNVs）。这些变异通过激活隐匿剪接位点，导致异常的mRNA剪接（如外显子跳跃、内含子保留），产生截短或无功能的蛋白，从而驱动了典型的、严重的Li-Fraumeni综合征表型，包括更早的癌症发病和经典的LFS肿瘤谱。这意味着，在评估TP53变异致病性时，忽略其剪接效应可能导致严重的误判，使部分高风险个体无法获得及时且适当的临床监测。
研究特别强调了整合多重证据的重要性。虽然SpliceAI等预测工具能有效初筛潜在剪接变异，但其预测分数不能量化正常剪接的保留程度，而后者可能显著影响变异的最终致病性。因此，必须辅以功能性验证（如小基因报告系统）和/或转录组水平证据（如肿瘤或患者来源RNA测序），才能实现精准分类。此外，不同细胞背景下的剪接验证结果可能存在差异，提示剪接调控具有组织特异性，这是在解读结果和推断临床意义时需要考虑的因素。
本研究具有重要的转化医学价值。它明确提示，在临床遗传学实践中，对TP53变异（特别是那些功能评价与临床怀疑不符的变异）的解读必须超越蛋白质中心视角，将剪接分析纳入标准评估流程。对于鉴定出的SE-SNVs，应考虑将其重新分类至更高的风险等级（如致病/可能致病）。未来，在患者外周血细胞等组织中开展等位基因特异性的转录本定量分析，将能更精确地评估正常与异常剪接产物的比例，从而为个体化的癌症风险分层和临床管理决策提供更可靠的依据。总之，这项研究深化了我们对TP53失活机制复杂性的理解，为改善LFS患者及其家族的精准医疗实践迈出了关键一步。
