综述：同步辐射蛋白质晶体学诞生50周年的回顾与展望

《Crystallography Reviews》：Perspectives on the 50th anniversary of synchrotron radiation protein crystallography

斯坦福同步辐射实验室（SSRL）1976年启动的蛋白质晶体学研究项目，在50周年之际回顾其历史影响。该项目通过开发多重波长相位（MAD）方法及改进同步辐射探测器技术，使90%的蛋白质晶体结构通过同步辐射装置确定，为AlphaFold预测蛋白结构奠定了数据基础。关键技术包括同步辐射源的多波长相位分析、微晶样品耐受性研究、探测器性能提升（如多丝 proportional chamber），以及与EXAFS结合的创新应用。未来发展聚焦时间分辨结构研究、药物靶点筛选、常温晶体学及多探针中心建设。

　　

摘要

2026年，将是斯坦福同步辐射实验室（SSRL）启动的同步辐射和蛋白质晶体学研究项目50周年纪念日。该项目由Keith Hodgson领导，并于1976年首次发表。这项开创性的研究在过去50年里推动了实验性蛋白质晶体结构的爆炸性增长，目前90%的蛋白质晶体结构都是通过同步辐射设施获得的。正是蛋白质数据库中累计的240,000个结构数据，为AlphaFold预测蛋白质折叠结构提供了基础。

关键词：

• 同步辐射
• 蛋白质晶体学
• 多波长相位法
• 蛋白质数据库
• 蛋白质折叠预测
• 未来发展

引言

2026年，斯坦福同步辐射实验室（SSRL）启动的同步辐射和蛋白质晶体学研究项目也将迎来50周年纪念。该项目由Keith Hodgson领导，并于1976年在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表（[引用1]）。为了纪念这一重要时刻，国际晶体学联合会（IUCr）的《同步辐射杂志》（JSR）特刊介绍了“Keith Hodgson领导的斯坦福SSRL同步辐射和蛋白质晶体学研究项目50周年”的相关内容。全球众多同步辐射和X射线自由电子激光（XFEL）设施都为该特刊提交了文章。这些文章由Helliwell和Szebenyi在[引用2]中进行了介绍：[https://journals.iucr.org/special_issues/2025/ssrlprotein/]。Keith Hodgson的这项开创性研究在过去50年里极大地推动了实验性蛋白质晶体结构的发展，如今90%的蛋白质晶体结构都是通过同步辐射设施获得的。

[引用1]中提到的第一篇参考文献来自德国汉堡的DESY同步辐射实验室，该论文探讨了生物衍射的广泛应用及同步辐射的巨大潜力。实际上，与SSRL的论文[引用1]同时发表的还有DESY的论文[引用4]。这三篇论文都具有重要意义。其中，Keith Hodgson提出的多波长相位法具有高度可调性（相关文献[引用5–8]对此进行了详细记录）。这些论文还介绍了使用两种不同X射线源（一种镍阳极，另一种钴阳极）对含铁蛋白质进行双波长相位测定的方法[引用9]。这些研究激发了我在该领域的实践探索[引用10]。Wayne Hendrickson提出的硒代甲硫氨酸蛋白质生产方法大大扩展了同步辐射技术的应用范围（[引用11]），同时他也进一步发展了多波长相位法（MAD，[引用12, 13]）。Helliwell先后在基尔大学、约克大学和曼彻斯特大学工作，并于1979年至2008年间在英国SSRL担任光束线科学家，期间建立了7.2、9.6和9.5号蛋白质晶体学光束线，为这一关键技术的发展做出了持续而重要的贡献。一个关键问题是如何确定足够的X射线波长以精确测量反射相位。Hoppe和Jakubowski[引用9]通过实际实验验证了所需波长的数量：对于红细胞蛋白来说，两个波长就足够实现分散差和异常差测量（总共三次测量）。Helliwell的实验室使用SSRL 9.5光束线详细研究了四种不同波长组合下的测量需求[引用14]。

在SSRL，Keith Hodgson领导了针对含铜黄瓜碱性蛋白质的研究，这是早期蛋白质晶体学研究的典范之一[引用15]。法国的LURE同步辐射设施以及NSLS等机构也进行了重要研究[引用12, 13]。Mukherjee、Helliwell和Main[引用17]将直接测量方法与SSRL 7.2光束线测得的异常差数据相结合，利用MULTAN程序确定了蛋白质中异常散射体的位置[引用18]。这一创新使得在MAD相位测定中处理大量异常散射体成为可能。为了高效定位大量异常散射体，开发了SHELXD软件[引用19]，该软件采用迭代双空间直接法，即基于倒空间相位精修和实空间峰值提取。

20世纪80年代中期至90年代，欧洲同步辐射设施（ESRF）在宏观分子晶体学领域的规划进一步推动了同步辐射在蛋白质晶体学中的应用。Keith Hodgson与斯坦福加速器物理学家Herman Winick共同组织的“New Rings Workshop”会议极大地促进了这些计划的实施。关键在于验证了20微米尺寸的微晶体能否承受这种高强度X射线的辐射和热冲击[引用21]。ESRF首次进行的MAD实验是在BM14光束线上进行的[引用22]。随后，SSRL、ESRF、CHESS和Elettra等机构在多波长异常分散技术方面取得了显著进展[引用23]。

Keith Hodgson在各种生物无机化学样品上的同步辐射EXAFS应用经验，使他能够在晶体学中的多波长相位法和EXAFS光谱测量方面发挥关键作用。国际晶体学联合会（IUCr）于1996年成立了XAFS专业委员会（[链接]）。

20世纪70年代，比传统胶片更先进的X射线探测器成为MAD相位法和宏观分子晶体学成功的关键因素（相关文献[引用24–26]）。在SSRL，Keith Hodgson领导的团队采用了多丝正比室（MWPC）技术，该技术对于确定黄瓜碱性蛋白质的晶体结构至关重要[引用15]。LURE的Fourme和Kahn将CERN的Radial Drift Chamber MWPC改进用于多波长相位测量。SSRL还与Enraf Nonius（剑桥MRC分子生物学实验室）、Rigaku Corporation（日本）和英国卢瑟福·阿普尔顿实验室合作，推动了相关技术的发展。这些改进的探测器各有优缺点，最终被瑞士PSI实验室开发的理想像素探测器所取代（[引用27]）。CCP4的MLPHARE程序利用多同质体替换技术实现了多波长相位测量[引用28]。随着探测器性能的提升（误差降低），单波长相位法成为常规方法，每个反射相位的不确定性通过溶剂平整技术得到解决（[引用29]）。

在MAD相位法的发展过程中也存在一些失误和暂时的挑战。例如，最初认为至少需要四个波长才能进行最小二乘相位分析（[引用14]），但实际上这一要求并不必要；Arndt提出的多色谱技术虽然在实际应用中得以实现（[引用30]），但后来被重新命名为DAFS（Diffraction Anomalous Fine Structure）。当同步辐射源的X射线强度随时间变化时，确保异常差同时测量以提高精度是一个重要的实验方法[引用32, 33]。

为了更全面地讲述这一发展历程，还需要提及一些关键进展。例如，随着第三代光源的出现，专门的微聚焦衍射仪应运而生（ESRF的相关研究[引用34]），使得样品尺寸显著减小。软X射线相位技术也得到了发展（相关综述[引用35]）。过去15年中，机器加速器中的多弯折消色器装置实现了前所未有的高分辨率[引用36]。在结构生物学领域，多项诺贝尔奖都与同步辐射蛋白质晶体学密切相关。

总结现状

目前，AlphaFold[引用37]在宏观分子晶体结构测定中占据主导地位，成为分子替代方法的基石[引用38]。蛋白质数据库中累计的240,000个结构数据为AlphaFold预测蛋白质折叠提供了支持。利用可变X射线波长的优化异常差技术在宏观分子晶体学中仍发挥着重要作用。大约三分之一的蛋白质属于金属蛋白，因此需要使用可调同步辐射光束线来确定金属类型和原子位置。Keith Hodgson在1976年的突破性研究彻底改变了宏观分子X射线晶体学的格局，如今90%的蛋白质晶体结构都是通过同步辐射设施获得的。

未来展望

除了结构测定和金属原子定位外，同步辐射在宏观分子晶体学领域还有其他发展趋势。首先，研究结构随时间变化的光束线技术成为重点，有助于阐明功能机制（参见Moffat和Lattman的著作[引用39]）。其次，为新药研发寻找新的结合片段，专门设计了相应的光束线（相关行业综述[引用40]）。此外，人们正在探索在“生理温度”（如37°C）以及嗜热和超嗜热生物体温度下测定宏观分子晶体结构的方法[引用41]。科学技术的普及使得同步辐射设施在电子冷冻显微镜等领域的应用也变得更为广泛（参见[引用42]）。这些设施及其相关方法为结构生物学家和结构化学家带来了巨大机遇。相关书籍[引用26]对这些进展进行了详细阐述。