芹菜素（Apigenin）通过调控Ca2+-介导的内质网应激延缓蛋鸡卵巢衰老

《Antioxidants》：Apigenin Prevents Ovarian Aging by Regulating Ca2+-Mediated Endoplasmic Reticulum Stress in Laying Chickens Wanyue Gao, Jing Dong, Yingyu Xiao, Xiangyu Cai, Zhaoyu Yang, Weidong Zeng, Caiqiao Zhang and Yuling Mi

本文揭示芹菜素（AP）通过抑制IP3R介导的Ca2+释放，恢复卵巢小白色卵泡（SWFs）胞内Ca2+稳态，减轻内质网应激（ERS）和细胞凋亡，从而缓解卵泡闭锁，显著改善高龄蛋鸡的产蛋性能与卵泡储备。该研究为利用天然黄酮类化合物干预家禽生殖衰老提供了新机制与潜在营养策略。

　　

1. 引言

在家禽产业中，产蛋后期蛋鸡的卵巢功能进行性衰退是制约生产可持续性的主要挑战。这一生殖功能下降的核心驱动力在于卵巢中小白色卵泡（Small White Follicles, SWFs）——即维持持续产蛋所必需的等级化前卵泡储备——的功能恶化与加速闭锁。尽管卵巢衰老涉及氧化损伤、自噬、铁死亡等多条通路，但内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）及其与细胞内钙离子（Ca²⁺）稳态失衡的相互作用在禽类卵泡衰老中的作用尚不明确。芹菜素（Apigenin, AP）作为一种天然黄酮类化合物，已知具有抗氧化活性，并在其他模型中显示出改善生殖功能的潜力。本研究旨在探究AP是否通过调节Ca²⁺稳态和ERS信号通路，对D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老模型及自然衰老蛋鸡的卵巢起到保护作用。

2. 材料与方法

研究采用480日龄的海兰白蛋鸡进行体内实验，设基础日粮对照组及添加100、300、500 mg/kg AP的日粮处理组。体外实验则从280日龄高峰期蛋鸡卵巢中分离SWFs，建立D-gal诱导的衰老模型，并设置对照、D-gal、AP预处理（AP+D-gal）及AP单独处理组。通过组织学染色（H&E、TUNEL、BrdU）、透射电镜观察、流式细胞术检测胞内Ca²⁺浓度、转录组测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及蛋白质印迹（Western Blot）等多种技术手段，系统评估了AP对卵泡形态、细胞增殖与凋亡、Ca²⁺相关基因表达、ERS标志物及下游凋亡信号的影响。此外，还监测了饲喂AP对高龄蛋鸡产蛋性能、卵泡等级分布、血清生化指标及蛋品质的影响。

3. 结果

3.1. AP减轻D-gal诱导的细胞凋亡并促进SWFs细胞增殖

组织学分析显示，D-gal处理破坏了颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）层的完整性，而AP处理保留了正常的卵泡结构。BrdU染色及PCNA、CCND1基因表达检测表明，D-gal抑制了细胞增殖，而AP处理使其恢复至接近对照水平。相反，TUNEL染色及BAX、CASP3、BCL2等基因表达分析显示，D-gal诱导了细胞凋亡，AP处理则显著降低了凋亡细胞比例并调节了凋亡相关基因的表达。

3.2. 转录组谱分析揭示AP调控衰老SWFs的关键通路

对对照组、D-gal组和AP+D-gal组的SWFs进行RNA-seq分析。主成分分析显示三组转录谱明显分离。差异表达基因分析及KEGG通路富集表明，D-gal处理显著富集了Ca²⁺信号通路，而AP处理则逆转了D-gal引起的ERS相关凋亡信号通路的富集。聚类热图显示，ITPR1、ATF4、ATP2A2、CASP3、CAMKII等与Ca²⁺信号和ERS通路相关的基因在AP处理后表达下调。

3.3. AP处理维持Ca²⁺稳态并减轻D-gal诱导的SWFs内质网应激

流式细胞术检测显示，D-gal处理显著提高了GCs内Ca²⁺水平，而AP处理有效缓解了这种异常升高。RT-qPCR结果显示，D-gal上调了多个Ca²⁺通道相关基因（ITPR1、ATP2B1、CAMKII、CACNA1C、CACNA1D、MCU）的表达，AP处理使其恢复正常。透射电镜观察发现D-gal引起内质网肿胀，AP处理则明显减轻了这种形态学改变。同时，ERS相关基因（GRP78、ATF4、ATF6、CHOP）的mRNA表达水平在D-gal组升高，经AP处理后恢复至接近对照水平。

3.4. IP₃R激活抵消芹菜素对Ca²⁺平衡、ERS和凋亡的保护作用

为验证AP的保护作用是否依赖于IP₃R介导的Ca²⁺信号通路，研究使用了IP₃R激动剂IP₃/AM。结果表明，AP对卵泡形态的保护作用及其对D-gal诱导的细胞凋亡的抑制作用，均可被IP₃/AM所逆转。同时，AP对ERS相关基因（GRP78、CHOP、ATF4、ATF6、ITPR1）表达的上调抑制作用也被IP₃/AM抵消。蛋白质印迹结果进一步证实，AP处理后降低的IP₃R、GRP78和CHOP蛋白水平，在IP₃R激活后重新升高。

3.5. AP补充维持高龄蛋鸡SWFs中的Ca²⁺稳态并减轻ERS

体内实验发现，与对照组相比，日粮中添加AP显著下调了高龄蛋鸡SWFs中Ca²⁺稳态相关基因（CACNA1C、CACNA1D、ITPR1、ATP2B1、CAMKII）的表达，并降低了IP₃R和CACNA1C的蛋白水平。同时，AP补充也有效减轻了ERS，表现为GRP78、CHOP、ATF4、ATF6基因转录本水平及GRP78和CHOP蛋白水平的下降。

3.6. AP减轻高龄蛋鸡SWFs及卵巢的细胞凋亡

组织学分析显示，AP补充组的SWFs中GCs排列更紧密，形态保存完好。TUNEL染色表明AP补充显著减少了SWFs及卵巢组织中的凋亡细胞数量。基因表达分析显示AP下调了促凋亡基因BAX和CASP3的表达，上调了抗凋亡基因BCL2的表达，并呈上调增殖相关基因PCNA和CCND1的趋势。蛋白质印迹证实BAX蛋白水平在AP处理后降低。

3.7. AP补充对产蛋性能及卵泡发育的影响

为期21天的饲养试验表明，AP补充显著提高了高龄蛋鸡的日产蛋率，增加了蛋重。卵泡等级分布分析显示，AP补充增加了大白色卵泡（LWFs）的数量，减少了闭锁小白色卵泡（ASWFs）的数量。相对卵巢重量在500 mg/kg AP组显著增加。在蛋品质方面，AP补充不同程度地提高了哈夫单位、蛋黄指数和蛋壳厚度。

4. 讨论与结论

本研究系统阐明了芹菜素延缓蛋鸡卵巢衰老的细胞分子机制。D-gal诱导的衰老及自然衰老均导致SWFs中IP₃R介导的Ca²⁺释放异常，引发胞质Ca²⁺超载和内质网钙库耗竭，进而触发ERS及随后的Caspase-3介导的凋亡通路，最终加速卵泡闭锁。芹菜素的核心保护作用在于其能够抑制IP₃R的过度激活，协调恢复CACNA1C、CACNA1D、CAMKII、MCU、ATP2B1等关键钙处理基因的表达，从而重建细胞内Ca²⁺稳态。Ca²⁺稳态的恢复有效缓解了ERS，表现为GRP78和CHOP等标志物水平下降，进而抑制了细胞凋亡，维持了GCs层的完整性和增殖能力。

体内研究进一步证实，日粮补充芹菜素能够显著改善高龄蛋鸡的卵巢储备功能，促进前等级卵泡的募集，提高血清孕酮水平，并最终提升产蛋性能和蛋品质。这些效应与体外机制研究高度一致，验证了芹菜素通过调节Ca²⁺介导的ERS通路来改善生殖功能的生物学相关性。

综上所述，本研究发现天然黄酮类化合物芹菜素是一种能够通过调控IP₃R-Ca²⁺-ERS轴来缓解蛋鸡卵巢衰老、延长其生产寿命的潜在营养干预剂，为开发提高家禽繁殖性能的功能性饲料添加剂提供了重要的理论依据和应用前景。