《International Journal of Molecular Sciences》：Age-Associated Metabolomic Changes in Human Spermatozoa
Mohd Amin Beg,
Md Shawkat Khan,
Ishfaq Ahmad Sheikh,
Taha Abo-Almagd Abdel-Meguid Hamoda,
Mohammad Imran Khan,
Priyanka Sharma,
Ali Hasan Alkhzaim,
Kenaz Basem Abuzenada,
Arif Mohammed and
Erdogan Memili
+ 2 authors
年龄相关的人类精子代谢组变化
引言
男性年龄相关的生育力下降在全球范围内日益凸显，这与生活方式选择变化和人口结构转变密切相关。尽管母体年龄的影响已被广泛研究，但父系年龄相关的生殖力衰退机制仍知之甚少。男性虽然终生都能产生精子，但年龄增长导致的精子结构和功能变化会显著降低受孕几率。这些变化包括睾酮水平下降、精液量减少、精子数量和质量降低、DNA碎片增加以及膜完整性受损。此外，衰老还增加精子中染色体异常、基因突变和表观遗传改变的可能性，从而对胚胎发育和子代健康产生不利影响。全球社会、生活方式和工业化进程促使许多夫妇推迟生育计划，导致父亲平均年龄显著上升。尽管父系衰老与不良生殖结局的关联性日益增加，但其对男性生育力的具体影响仍未得到充分阐明。代谢组学能够全面分析细胞内的低分子量化合物，是反映细胞整体生理状态的敏感指标。在男性生育力研究中，代谢组学有助于揭示精子功能障碍背后的病理生物学机制，识别与精子活力、代谢和受精相关的关键代谢物。然而，目前关于衰老与精子代谢组学的研究非常有限。
结果
2.1. 精液分析
近期一项研究详细报告了本研究中三个年龄组男性的平均年龄和精液各项参数，并总结于表格中。简而言之，除了男性年龄和精子浓度外，其他精液参数在各组间的比较均无显著差异。三个年龄组男性的平均年龄存在显著差异。年轻成人组的平均精子浓度显著低于晚成人组，但与高龄组的比较无显著差异。
2.2. 精子代谢组
2.2.1. 三个年龄组的整体代谢组学分析
代谢组学分析共处理了三个年龄组精子中的469个已识别特征。通过人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）注释，共鉴定出380种代谢物。精子中的主要代谢物成分包括脂质和类脂分子、核苷、核苷酸及其类似物、有机酸及其衍生物以及有机氧化合物。研究发现，在所有高龄组样本的精子中，L-同型半胱氨酸（L-homocysteine）的含量几乎检测不到，而在年轻成人组中其含量较高。相反，甲基十八烷酰辅酶A（methyloctadecanoyl-CoA）在年轻成人组和晚成人组所有样本的精子中含量几乎检测不到，但在高龄组中却大量存在。
初始的无监督主成分分析显示，年轻成人组和高龄组的代谢物丰度数据形成了两个明显独立的簇，表明两组之间存在显著的代谢差异。晚成人组的数据则显示出与两个组均有关的过渡性分布。前两个主成分分别解释了代谢组数据集中49.9%和17.7%的方差。差异代谢物的层次聚类和热图分析显示，高龄组相对于年轻成人组，其上调（红色）和下调（蓝色）的代谢物存在明显区分，而晚成人组的代谢物丰度则没有清晰的界限，与另外两组均有重叠。
方差分析显示，在380种代谢物中，有164种在三个年龄组间存在显著差异。偏最小二乘判别分析进一步表明，年轻成人组与高龄组存在差异，而晚成人组处于中间位置。稀疏偏最小二乘判别分析进一步验证了该模型，并清楚显示了年轻成人组和高龄组代谢物数据之间的分离。随机森林模型对三个年龄组的累积错误率分析也显示年轻成人组与高龄组之间存在差异。
2.2.2. 成对组分析
对年轻成人组和高龄组数据的火山图分析显示，在380种代谢物中，有153种在两组间存在显著变化。其中82种代谢物下调，71种上调。主成分分析再次证实年轻成人组和高龄组的数据形成了两个独立的簇。偏最小二乘判别分析和稀疏偏最小二乘判别分析进一步验证了模型，并确认了两组代谢物数据的清晰分离。单变量生物标志物分析显示，共有197种代谢物的受试者工作特征曲线下面积大于0.9，其中137种达到了完美的1.0。表格2展示了ROC值为1.0的前25种差异表达代谢物。前10种生物标志物的箱线图清晰地显示了它们在年轻成人组和高龄组间的丰度差异。在这前10种代谢物中，十五烷酰辅酶A（pentadecanoyl-CoA）、TG(21:0/a-25:0/a-25:0)、(3S)-3-羟基亚油酰辅酶A（(3S)-3-hydroxylinoleoyl-CoA）、心磷脂CL(22:6/20:4/22:6/22:6)、CDP-DG(LTE4/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、尿嘧啶（uracil）、PIP(TXB2/22:3(10Z,13Z,16Z))和PIP(18:3(9Z,12Z,15Z)/PGE2)在高龄组中丰度较高，而(S)-羟基辛酰辅酶A（(S)-hydroxyoctanoyl-CoA）和DG(22:6/18:4)则显著降低。
定量富集分析揭示了97个关键且显著富集的代谢过程。这些富集通路包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢、酮体代谢、磷脂生物合成、柠檬酸循环、糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢、长链饱和脂肪酸的线粒体β-氧化、脂肪酸代谢等。以L-同型半胱氨酸和谷胱甘肽的途径化合物-反应-酶-基因网络为例，阐明了它们在调节氧化应激中的相互关联作用。
年轻成人组与晚成人组、晚成人组与高龄组的成对分析均未显示各组间的单独聚类，其95%置信区间椭圆相互交叉。热图分析证实了数据的重叠，火山图分析分别揭示了年轻成人组与晚成人组间有18种代谢物存在丰度差异，晚成人组与高龄组间有25种代谢物存在丰度差异。这些差异代谢物均包含在年轻成人组与高龄组的差异代谢物中。
讨论
本研究发现高龄组精子代谢物丰度发生了显著改变，表明衰老可能导致分子层面的破坏，从而损害精子功能。精液的宏观和微观分析显示，除了晚成人组精子浓度高于年轻成人组外，三个年龄组在其他精液参数上均无显著差异。这与先前关于精液参数随年龄恶化但结果存在混合性的报告一致。
代谢组学分析在三个年龄组中鉴定出380种代谢物。脂质和类脂分子最为丰富，其次是核苷、有机酸衍生物、有机氧化合物和有机杂环化合物，有机氮化合物最少。这与先前在人类、公牛和公猪精子中报道的代谢物分布相似，强调了它们在精子结构完整性、能量代谢以及整体生理和发育功能中的关键作用。
无监督和有监督的统计分析一致揭示了年轻成人组与高龄组精子代谢物丰度的明显分离，形成了两个区分良好的簇。这种区别是由于164种代谢物在年龄组间存在显著差异。值得注意的是，L-同型半胱氨酸在所有高龄样本中几乎检测不到，而甲基十八烷酰辅酶A在年轻和晚成人组中几乎检测不到，但在高龄组中大量存在，这表明精子中存在明显的年龄相关代谢改变。
L-同型半胱氨酸是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，在再甲基化和转硫途径中至关重要，高同型半胱氨酸血症与多种疾病相关。甲基十八烷酰辅酶A是一种来自脂肪酸的长链酰基辅酶A，是脂质代谢中的关键中间体，可作为β-氧化和复杂脂质生物合成的底物。在本研究中，甲基十八烷酰辅酶A在高龄男性的精子中含量丰富，而在年轻组中几乎检测不到。虽然其意义尚不清楚，但组织中过量的酰基辅酶A积累与脂毒性和细胞生理功能受损有关，值得进一步研究其在精子功能和年龄相关生殖衰退中的作用。
关于人类衰老与精子代谢组学的研究目前缺乏。然而，一项研究检查了在生育咨询的较年轻（26-30岁）和较年长（45-54岁）男性中全精液的代谢组学特征。潜在受损的生育力可能混淆了该报告中的年龄相关效应。本研究发现高龄组有153种代谢物发生改变，支持了谷胱甘肽水平降低，但与之相反，尿嘧啶在高龄组中上调。这种差异的原因尚不清楚，可能与报告研究中的全精液代谢组学与本研究中纯化的精子代谢组学不同有关。本研究中尿嘧啶的上调得到了CTP同时下调的进一步支持，这表明了年龄相关的嘧啶代谢紊乱，可能反映了核苷酸生物合成受损以及RNA周转或降解增加。
在本衰老研究中，生物标志物分析确定了137种AUC为1的代谢物，表明它们有潜力成为高级精子衰老的稳健生物标志物。因此，讨论聚焦于以下关键潜在生物标志物代谢物。
几种饱和脂肪酰辅酶A在高龄男性的精子中失调。十五碳烯酰辅酶A、丙酰辅酶A、HMG辅酶A和羟基二十碳酰辅酶A上调，而(S)-羟基辛酰辅酶A、(3R)-3-羟基辛酰辅酶A和丙二酰辅酶A半醛下调。十五烷酰辅酶A在衰老中的作用尚不清楚。丙酰辅酶A的上调可能损害精子能量代谢，并可能影响ATP可用性和精子活力。HMG辅酶A的增加可能破坏胆固醇生物合成和膜重塑，而这对精子获能至关重要。羟基二十碳酰辅酶A的上调可能反映了向改变的脂质和中间代谢的转变，可能破坏线粒体能量产生并损害精子活力。(S)-3-羟基辛酰辅酶A、(3R)-3-羟基辛酰辅酶A和丙二酰辅酶A半醛的下调表明短链脂肪酸代谢受损，这可能损害线粒体效率，但它们在衰老精子中的作用需要进一步研究。
几种单不饱和脂肪酰辅酶A，包括(2E)-二十六碳烯酰辅酶A、油酰辅酶A和7-羟基辛-3-烯二酰辅酶A在高龄精子中上调，而棕榈油酰辅酶A下调。失调的单不饱和脂肪酸与弱精症、弱畸精子症和少弱畸精子症男性的精液质量差、精子膜脂质代谢紊乱以及膜完整性和功能受损有关。棕榈油酰辅酶A的下调可能影响胆固醇稳态和精子膜动力学，导致与精子获能相关的信号传导问题。
多不饱和脂肪酰辅酶A(3S)-3-羟基亚油酰辅酶A的上调和花生四烯酸乙酯的下调在高龄精子中的意义需要进一步研究。然而，多不饱和脂肪酸代谢物的失调可能损害精子膜完整性、氧化还原平衡和功能能力，导致精子活力差。
几种心磷脂在高龄精子中发生改变，包括上调的CL(22:6/20:4/22:6/22:6)，以及下调的CL(i-16:0/a-17:0/i-17:0/20:0)和CL(14:0/14:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18:2(9Z,12Z))。这些特定心磷脂种类在衰老精子中的具体功能作用尚不清楚；然而，心磷脂是线粒体内膜的关键磷脂，对线粒体生物合成、呼吸和蛋白质输入至关重要，它们的失调可能反映了精子线粒体完整性和生物能量效率受损。
几种三酰甘油在高龄精子中发生改变，包括上调的TG(21:0/a-25:0/a-25:0)和TG(22:1(13Z)/24:1(15Z)/24:1(15Z))，以及下调的TG(14:0/20:3(5Z,8Z,11Z)/16:1(9Z))。所指示的特定TG种类在年龄相关精子功能中的具体作用尚不清楚，需要进一步研究。然而，三酰甘油调节脂质储存和运输。它们的上调可能会减少膜重塑和能量生产所需的游离脂肪酸的可用性，而三酰甘油的下调则与弱精症、衰老、胰岛素抵抗和不育有关。
几种二酰甘油在高龄精子中发生改变，包括上调的CDP-DG(LTE4/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))，以及下调的DG(22:6/18:4)。二酰甘油种类的丰度降低可能损害顶体反应性、膜融合能力和精子-卵母细胞相互作用。CDP-DG的上调可能通过氧化和炎症机制导致年龄相关的精子功能障碍，损害精子活力和功能能力。
几种磷脂酰丝氨酸在高龄精子中发生改变，包括下调的PS(16:0/15:0)和PS(24:0/18:1(9Z))。这些代谢物在精子功能中的具体意义尚不清楚。磷脂酰丝氨酸是精子质膜的关键成分，有助于膜完整性、细胞凋亡、获能和精子-卵子融合。磷脂酰丝氨酸水平降低可能损害膜稳定性，并影响膜动力学、获能效率和衰老精子与卵母细胞的相互作用，并与男性不育有关。
磷脂酰肌醇磷酸代谢物PIP(TXB2/22:3(10Z,13Z,16Z))和PIP(18:3(9Z,12Z,15Z)/PGE2)在高龄精子中上调。磷脂酰肌醇磷酸调节氧化应激、细胞衰老、精子发生和精子-卵子融合，支持生育力和精子成熟。磷脂酰肌醇磷酸的上调可能破坏精子中钙信号传导、膜重塑和融合事件，而这些是成功受精所必需的。
磷脂酰胆碱代谢物PC(20:0/TXB2)在高龄精子中下调。PC(20:0/TXB2)水平的降低可能损害膜流动性和钙信号传导，从而损害精子活力和顶体反应。在少精症和特发性不育男性的精子中已报道磷脂酰胆碱水平降低。
鞘脂代谢物神经节苷脂GD3在高龄组精子中下调，这可能破坏膜组织和鞘脂依赖性信号传导，可能损害获能和精子-卵子相互作用。
前列腺素代谢物PGD1在高龄组精子中下调。PGD1减少可能损害活力和获能。精液中几种前列腺素水平降低与男性弱精症有关。
几种核苷及其衍生物在高龄精子中显著改变。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）上调，而黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、肌苷一磷酸（IMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、ADP-α-D-葡萄糖和尿苷二磷酸（UDP）下调。NADP+调节氧化还原平衡、线粒体功能、代谢和精子获能，其上调表明衰老精子在升高的氧化应激下存在年龄相关的细胞氧化还原稳态重塑。FAD对线粒体氧化还原反应至关重要，支持精子代谢和功能，其下调表明氧化代谢和ATP产生受损，可能影响精子活力和生存能力。IMP减少意味着嘌呤代谢受损，cGMP减少可能表明获能和顶体反应受损，UDP减少表明精子成熟受损。
几种有机酸在高龄精子中显著改变。D-γ-谷氨酰-D-谷氨酸和高胱氨酸上调，而L-同型半胱氨酸、N-十四烷酰丝氨酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、L-精氨酰琥珀酸和细胞周期蛋白D1下调。高胱氨酸（L-同型半胱氨酸的氧化产物）的上调表明衰老精子中氧化还原失衡。尽管本研究衰老精子中L-同型半胱氨酸水平改变或可忽略不计的生物学意义尚不清楚，但这些变化可能与氧化应激增强和线粒体功能障碍有关。L-同型半胱氨酸作为半胱氨酸的前体，对谷胱甘肽（一种主要的细胞内抗氧化剂）的合成至关重要。它的消耗可能损害氧化还原稳态，加剧氧化应激，破坏甲基化反应，并损害睾丸功能。N-十四烷酰丝氨酸在精子中的作用尚不清楚，但在信号传导和代谢稳态等方面发挥作用。L-半胱氨酸保护公牛免受睾丸损伤并改善精子质量。苹果酸减少与精液质量差有关。谷胱甘肽保护精子免受氧化损伤；其耗竭会损害不育男性的精子活力，而补充谷胱甘肽可改善精子质量。在大鼠睾丸中也观察到了衰老相关的谷胱甘肽减少。细胞周期蛋白D1调节小鼠的精子发生。
几种有机氧化合物在高龄精子中下调，包括1,6-二磷酸果糖、1,7-二磷酸景天庚酮糖、乙酰辅酶A和胞苷三磷酸（CTP）。1,6-二磷酸果糖减少表明精子糖酵解通量降低，可能限制了鞭毛运动和精子活力所需的ATP可用性。1,7-二磷酸景天庚酮糖的下调可能表明细胞对氧化应激的反应受损，增加了对活性氧介导损伤的易感性。乙酰辅酶A的下调意味着氧化磷酸化受损，导致能量产生减少、线粒体功能受损和精子活力降低。CTP减少表明核苷酸代谢改变，可能影响RNA合成、膜磷脂生物合成和精子成熟过程。
几种杂环化合物在高龄精子中显著改变。值得注意的是，尿嘧啶上调，而十二碳烯二酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和硫胺素二磷酸下调。精子中尿嘧啶的上调可能反映了RNA降解增加、RNA加工受损或核苷酸补救途径失调，可能影响精子成熟和功能所需的转录后调控和蛋白质合成。尿嘧啶的上调得到了CTP同时下调的进一步支持，这表明了年龄相关的嘧啶代谢紊乱。这种不平衡可能对膜磷脂合成、RNA依赖性过程以及随着年龄增长的整体精子功能能力产生不利影响。乙酰乙酰辅酶A的下调表明胆固醇生物合成减少，这可能损害膜流动性、获能效率和受精能力。硫胺素二磷酸（维生素B1）的减少表明碳水化合物氧化受损和能量效率降低，这可能对精子活力和生存能力产生负面影响。
定量富集分析揭示了精子中几种代谢途径的显著年龄相关改变，包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢、酮体代谢、磷脂生物合成、柠檬酸循环、脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢。牛磺酸和亚牛磺酸代谢对抗氧化、活力和受精至关重要，可能受L-半胱氨酸减少的影响。酮体代谢可增强精子活力，并受琥珀酰辅酶A上调和乙酰乙酰辅酶A下调的影响，可能影响能量产生。磷脂生物合成对精子膜结构和活力至关重要，通过磷脂的改变而受到干扰。氧化磷酸化和糖酵解的柠檬酸循环为精子功能提供能量，并受年龄相关的苹果酸、ATP、琥珀酰辅酶A和FAD改变的影响。谷胱甘肽代谢对氧化还原平衡、精子能量代谢和精子活力很重要。谷胱甘肽是一种主要的细胞内抗氧化剂，对中和活性氧至关重要。在这方面，L-同型半胱氨酸是甲硫氨酸循环中的关键中间体，可通过调节谷胱甘肽合成来影响氧化还原平衡。这个网络的破坏会加剧氧化损伤，从而影响精子功能和完整性。该途径中NADP+、ATP、L-半胱氨酸和FAD的年龄相关失调可能对精子功能产生潜在影响。
总之，这项研究确定了与年龄相关的精子代谢组谱差异，这些差异可能导致精子发育和功能的改变。虽然应用了稳健的无监督和有监督统计方法，但相对较小的样本量以及多种候选代谢物的鉴定需要谨慎解释。鉴于此前缺乏对人类精子代谢组学年龄相关变化的研究，本研究结果为了解年龄相关的精子代谢组改变提供了初步框架。因此，需要在更大、独立且特征明确的队列中进行验证，同时考虑生活方式、体力活动和其他潜在混杂因素，以确认所识别代谢物的稳健性、生物学相关性和转化潜力。
材料与方法
4.1. 研究设计与样本收集
本研究方案获得了沙特阿拉伯吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学基因组医学与研究中心生物伦理委员会的批准。研究设计和样本收集已在近期的一项研究中详细描述。简而言之，招募了21-51岁、已自然生育至少一个孩子的健康可育阿拉伯/沙特已婚男性，在知情同意和全面泌尿外科评估后参与。在阿卜杜勒阿齐兹国王大学法赫德国王医学研究中心禁欲3-5天后收集精液样本。排除有生殖、遗传、全身性或精液异常的男性。在24名招募的男性中，18份合格样本被纳入，并分为三个年龄组：21-30岁、31-40岁和41-51岁，这反映了生殖活跃的十年以及成为父亲的三个最高百分比贡献年龄段。41-50岁年龄组被认为是高龄父亲，因为多项研究已确定40岁左右是精液质量、数量和整体生育潜力开始显著下降的关键阈值。
4.2. 精液分析、处理和精子纯化
精液样本在37°C孵育30分钟液化，并按照世界卫生组织方案进行分析。简而言之，精液的宏观检查包括评估精液量、pH值、稠度和颜色。使用Makler计数板或载玻
