《International Journal of Molecular Sciences》：Intestinal Microbiota Mediates the Beneficial Effects of γ-Polyglutamic Acid on Calcium Homeostasis and Bone Properties in Lambs
Xingfu Zhang,
Lili Guo,
Yabo Zhao,
Wurilege Wei,
Jing Zhang,
Lingli Dai,
Bin Yang,
Zaixia Liu,
Xu Wang and
Liwen Song
+ 6 authors
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本研究发现，在苏尼特羔羊日粮中添加1.2 g/(d·头)剂量的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)可重塑肠道菌群，并通过“肠道-微生物-内分泌-骨轴”多途径协同调控，优化钙吸收与骨代谢。其机制包括：改善十二指肠形态、上调钙转运蛋白(TRPV5/6, CaBPD9k, PMCA1b, claudin-12等)表达、调节钙调激素(1,25-(OH)2-VitD3, PTH, FGF23)，进而促进骨骼健康，为研发新型氨基酸基反刍动物饲料添加剂提供了科学依据。
摘要
本研究首次在反刍动物中系统评估了γ-聚谷氨酸(γ-PGA)对钙代谢和骨骼健康的影响。24只苏尼特羔羊被随机分为四组，分别饲喂0、0.6、1.2或2.4 g/(d·头)剂量的γ-PGA，持续60天。结果表明，1.2 g/(d·头)的中等剂量(M组)效果最佳，显著提升了终末体重和体格指标，优化了钙代谢。这项研究揭示了γ-PGA通过协调调控肠道完整性、钙转运、全身内分泌反应和十二指肠微生物群落，来增强羔羊钙吸收和骨代谢的多维机制，并识别出特定的核心菌群作为潜在的关键介导者。
1. 引言
钙是反刍动物生长、发育和生产的关键矿物质。与单胃动物不同，反刍动物的钙稳态依赖于胃肠道吸收和动态骨动员之间的协同作用，肾脏排泄作用微乎其微。肠道钙吸收主要通过两种途径：一是跨细胞途径，涉及钙离子通过瞬时受体电位香草酸亚型通道TRPV5和TRPV6进入细胞，与钙结合蛋白D9k(CaBPD9k)结合，并通过钠钙交换体NCX1和质膜钙ATP酶PMCA1b排出细胞；二是旁细胞途径，由紧密连接蛋白如claudin-2和claudin-12介导，顺浓度梯度被动扩散。
钙稳态由钙调激素调节，包括骨化三醇(活性维生素D)、甲状旁腺激素(PTH)和成纤维细胞生长因子23(FGF23)。肠道钙吸收主要受1,25-二羟基维生素D调节，它与肠道维生素D受体(VDR)结合激活基因转录，增加TRPV6、CaBPD9k、NCX1和claudin-2/12的表达，从而增强跨细胞和旁细胞钙转运。骨化三醇通过增强破骨细胞活性促进骨吸收和钙动员，并通过激活成骨细胞支持骨矿化。FGF23降低血钙、PTH和骨化三醇水平。PTH和骨化三醇共同刺激破骨前体细胞成熟，促进骨吸收和钙释放入血。PTH也增强维生素D途径，促进胃肠道钙吸收。
尽管有多种钙补充剂，但其低吸收效率、胃肠道刺激和生物利用度不一致等局限性仍然存在。因此，需要新型、生物相容性好且能增强钙吸收而无不良反应的补充剂。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然的阴离子可生物降解假多肽，成为一种有前景的候选物。它无毒、无免疫原性，广泛应用于食品、饲料和制药工业。重要的是，γ-PGA可以螯合钙离子，提高其溶解度和吸收率。小鼠研究表明，γ-PGA能促进肠道钙摄取，增加体内钙含量，并比无机钙更有效地支持骨骼发育。此外，在绵羊中，γ-PGA已被证明可调节瘤胃微生物群和功能，表明其在影响胃肠道环境以增强营养物质利用方面的潜在作用。
肠道微生物在钙吸收中发挥积极作用。特定的细菌类群(如Oscillibacter, Bacteroides)和微生物代谢物(如源自纤维发酵的丁酸盐)与增强钙吸收有关。越来越多的证据将肠道微生物生态与骨骼健康联系起来，表明微生物可以通过免疫和内分泌调节影响骨量和结构。因此，有效的钙补充剂不仅可以直接作用于宿主的吸收途径，还可以通过塑造有益的肠道菌群间接发挥作用。
苏尼特羊是来自蒙古高原的一种耐寒本土品种，因其肉质和适应性而备受重视。然而，γ-PGA作为该品种的钙增强补充剂的潜力及其潜在机制尚未被探索。基于现有研究，我们假设γ-PGA可以通过涉及肠道微生物和内分泌激素的机制，促进绵羊的肠道钙吸收和骨骼利用。
2. 结果
2.1. γ-PGA对苏尼特羔羊生长性能的影响
日粮添加γ-PGA对体高、体长和胸围有显著处理效应，体重显示出不显著的趋势。时间效应对所有性状均极显著。组别×时间的交互作用仅在体高上被检测到，表明γ-PGA对体高的影响随时间推移而更加明显。在第60天，低剂量组(L组，0.6 g/(d·头))表现出最大的体高、体长和胸围。中剂量组(M组，1.2 g/(d·头))显示出最高的体重，而高剂量组(H组，2.4 g/(d·头))总体呈中等水平。对整体平均日增重的立方多项式回归分析确定1.2 g/(d·头)为最佳剂量。
2.2. 血清矿物质、激素和抗氧化状态
血清钙和磷浓度保持稳定，不受γ-PGA补充的显著影响。与蛋白质和脂质代谢相关的血清生化指标也未观察到显著处理效应。相比之下，关键的钙调节激素循环水平在第60天表现出明显的剂量依赖性变化。血清骨化三醇、甲状旁腺激素(PTH)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)和降钙素(CT)均随着γ-PGA补充量的增加而逐步升高，显示出显著的线性和二次趋势。在第60天，M组和H组的激素浓度普遍显著高于对照组。在第30天，仅FGF23响应显著。抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的活性以二次、剂量依赖的方式被γ-PGA调节。在第30天和第60天，SOD和GSH的活性均在M组达到峰值，并显著高于对照组和H组。
2.3. 十二指肠形态和钙转运蛋白表达
十二指肠和回肠食糜中钙和磷的浓度未受日粮处理的显著影响。然而，回肠磷浓度在γ-PGA剂量梯度上显示出线性和二次增加趋势。尽管未达到统计学显著性，但十二指肠绒毛高度和隐窝深度在L组和M组显示出比对照组(C组)更明显的增加趋势，其中M组的数值最大。代表性的苏木精-伊红(H&E)染色和透射电镜(TEM)显示，与对照组相比，M组的肠上皮细胞拥有排列更紧密的微绒毛和更丰富的线粒体。
与形态学观察结果一致，参与肠道钙吸收的关键介导因子的蛋白表达在M组中显著上调。这包括跨细胞转运蛋白(TRPV5, TRPV6, CaBPD9k, NCX1, PMCA, VDR)和旁细胞转运蛋白(claudin-12)。如图所示，与C组相比，M组在十二指肠和回肠组织中所有测量的转运蛋白的蛋白水平均有所增加。
2.4. 骨骼微结构
股骨干骺端的显微计算机断层扫描分析显示，日粮添加γ-PGA改变了几项骨小梁参数。几项指示骨小梁结构的参数显示出显著的剂量依赖性变化。结构模型指数(SMI)随着γ-PGA剂量的增加而显著增加，从C组的-0.87上升到H组的0.83。SMI值接近0和+3表示从理想的板状结构向更杆状结构的转变，表明骨小梁形态发生了剂量相关的改变。与此一致，骨小梁模式因子(Tb.Pf)也显示出显著的剂量依赖性增加，骨表面积与骨体积比(BS/BV)也呈上升趋势，进一步意味着向更多、更细的骨小梁元素转变。
有趣的是，反映连接性和密度的参数呈现出更复杂、非线性的情况。连接密度(Conn.D)显示出组间差异趋势，并表现出显著的二次响应，最高值出现在中剂量的M组。相反，骨小梁腔的CT衰减值(TbCav.CT_Value)随着γ-PGA的增加呈下降线性趋势。骨矿物质密度(BMD)也表现出下降趋势。其他静态参数如骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)或骨矿物质含量(BMC)未观察到显著差异。骨湿重和干重也不受处理影响。
总之，γ-PGA补充并未增加BV/TV和BMD所测量的骨量或矿物质密度。相反，它诱导了显著的结构变化，其特征是从板状骨小梁向杆状骨小梁转变(SMI和Tb.Pf增加)，以及表面复杂性增加的趋势(BS/BV增加)。骨小梁腔CT衰减值降低的趋势，以及BV/TV和BMD的非显著变化，表明观察到的结构重塑并未伴随净矿物质沉积的增强。Conn.D在M组达到峰值，提示可能存在一个维持骨小梁连接性的最佳剂量，尽管整体结构有向杆状转变的趋势。
2.5. 十二指肠菌群组成和多样性
对十二指肠样本进行16S rRNA测序，共获得1,723,809条有效读数。在门水平，厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)和螺旋体门(Spirochaetota)占主导地位。与C组相比，随着γ-PGA水平的增加，厚壁菌门和放线菌门呈现出先增后减的趋势，拟杆菌门和螺旋体门先减后增，而变形菌门则表现出显著的先减后增趋势。在属水平，优势菌属包括Olsenella、Prevotella、Sharpea、Ruminococcus、Bifidobacterium、Roseburia、unclassified[Eubacterium]coprostanoligenes_group、Acetitomaculum、Lachnospiraceae_NK3A20_group和Succinivibrio。在种水平，最丰富的类群包括Parafannyhessea umbonata、Sharpea azabuensis、Prevotella ruminicola等。α多样性指数结果显示，Shannon多样性指数随γ-PGA补充量的增加而发生显著变化。L组的多样性显著低于H组，而M、H、C组之间无显著差异。Chao1指数和Simpson指数显示四组间物种丰富度和均匀度无显著差异。
2.6. 差异微生物丰度
线性判别分析效应量(LEfSe)结果显示，在M组中，Bifidobacterium thermophilum丰度较高；在H组中，Prevotella ruminicola、Negativicutes、Acidaminococcaceae、Succiniclasticum、Spirochaetia、Spirochaetaceae和Spirochaetales在高剂量γ-PGA补充下丰度较高。相比之下，Veillonellales Selenomonadales、Selenomonadaceae、Coriobacteriaceae bacterium KH1P3和Selenomonas ruminantium在C组中更为丰富。
2.7. 微生物共表达网络及其与宿主表型的关联
十二指肠菌群的加权OTU共表达网络分析(WOCNA)识别出七个不同的共丰度模块。模块特征基因与宿主表型性状的相关性分析揭示了几种显著且具有生物学意义的关联。黄色模块与有益的宿主结果关联最为显著。它与生长性能和关键的十二指肠钙转运蛋白和通道的蛋白表达呈正相关，与血清降钙素水平呈负相关。相比之下，蓝色模块和棕色模块与促进钙吸收和骨转换的血清激素(骨化三醇和FGF23)呈显著负相关。棕色模块还与PTH和饲料效率呈负相关。其他模块与特定性状相关联。
网络拓扑分析确定了具有高连接度的几个菌属，表明它们可能作为枢纽类群。蓝色模块中，Fusicatenibacter、Leuconostoc、Salipaludibacillus和Staphylococcus的连接度最高。在青绿色模块中，Treponema、Pyramidobacter、Rikenellaceae RC9 gut group和Prevotella的连接度最高。棕色模块以Family XIII AD3011 group为主。黄色模块在unclassified RF39、Methanobrevibacter、[Eubacterium] ruminantium group、unclassified Clostridia UCG-014和Erysipelotrichaceae UCG-006中显示出高连接度。
3. 讨论
本研究首次提供了综合证据，表明日粮补充γ-PGA通过协调的“肠道-微生物-内分泌-骨轴”与生长反刍动物的钙代谢和生长性能变化相关。基于对生长、十二指肠结构、骨骼微结构和微生物群落的综合分析，确定1.2 g/(d·头)是苏尼特羔羊的最佳剂量。
对生长性能的混合模型分析显示，处理对体高、体长和胸围有显著效应。体高显著的组别×时间交互作用表明，γ-PGA对纵向生长的影响随时间推移而加剧。第60天时，L组(0.6 g/d)在体尺指标上数值最大，而M组(1.2 g/d)的体重数值最高，立方多项式回归将1.2 g/d确定为平均日增重的最佳剂量。
肠道吸收过程在反刍动物中尤为关键。本研究测量了M组中十二指肠和回肠钙结合及紧密连接蛋白的蛋白水平。透射电镜证实，γ-PGA不仅增强了十二指肠细胞的细胞内钙转运，也改善了细胞间吸收。相比之下，回肠主要支持细胞内钙转运。小鼠研究表明，claudin-2和claudin-12形成互补的孔道以维持钙稳态。当钙浓度超过血浆水平时，钙可以通过由这些连接蛋白调节的旁细胞途径进入肠道。
本研究使用的γ-PGA分子量范围为15-20 kDa，纯度为33.03%。研究发现，γ-PGA未显著影响生化或脂质代谢指标，也未显著影响总平均日增重。γ-PGA并未直接改变血浆钙或磷水平，这与血钙和血磷在狭窄范围内保持稳定的特性一致。通过比较抗氧化指标、钙磷水平和钙调节激素的短期和长期变化，观察到γ-PGA抑制了降钙素水平，并随着时间推移增强了抗氧化能力。长期γ-PGA补充显著增加了骨化三醇、PTH、降钙素和FGF23的水平。总之，γ-PGA支持钙吸收，并且为了维持钙磷稳态，激素反应按顺序运作并相互补充。
本研究的第二个目标是通过分析肠道微生物16S rRNA和骨骼参数，探究γ-PGA促进肠道和骨骼钙摄取的机制。物种累积曲线表明测序深度足够。在本研究中，γ-PGA未显著改变细菌多样性，但细菌群落的基因表达浓度增强，且优势菌属大多是有益的。其中，Eubacterium coprostanoligenes group是促进丁酸消化吸收的优势类群，Acetitomaculum是产丁酸益生菌，Lachnospiraceae NK3A20 group参与多种碳水化合物代谢，Ruminococcus产生丙酸和乙酸并有助于纤维素和淀粉降解，Bifidobacterium通过调节破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成来改善骨骼健康。
WOCNA R软件包将肠道菌群属水平的表达分为七个共表达基因簇，并分析了每个模块与生理性状的相关性。这些关联模块被导入Cytoscape软件以计算网络属性并识别与特定性状相关的核心调节微生物。棕色模块的核心微生物(Family XIII AD3011 group, Methanobrevibacter, [Eubacterium] nodatum group)在钙磷相关激素的负调节以及干物质采食量和饲料转化率的正调节中起关键作用。蓝色模块的核心微生物Fusicatenibacter属于厚壁菌门(产丁酸细菌)。丁酸在肠道中具有已知的抗炎特性，可增强消化酶活性和胰腺分泌，促进犊牛小肠发育，并降低腹泻发生率。蓝色模块与总平均日增重、骨化三醇、FGF23水平以及肠道钙吸收蛋白呈负相关，与十二指肠钙浓度呈正相关。总之，Fusicatenibacter、Family XIII AD3011 group、Methanobrevibacter及相关微生物有助于改善补充γ-PGA的苏尼特羔羊的十二指肠钙吸收、干物质采食量和饲料转化率。
幼龄动物的骨密度随着年龄增长而增加，需要钙和磷酸盐以羟磷灰石的形式沉积以强化骨基质。本研究中，γ-PGA补充显著改变了骨小梁微结构，表现为骨小梁模式因子(Tb.Pf)和结构模型指数(SMI)增加。这些参数表明骨小梁结构向更杆状的结构转变。然而，在骨重塑激素(PTH, FGF23, 骨化三醇)升高和肠道钙吸收增加的背景下，这些变化更可能反映了增强的骨重塑动力学，而非骨质量的明确改善或恶化。在快速生长的羔羊(5-6月龄)中，骨骼经历连续的塑形和重塑以适应不断增加的机械负荷和矿物质需求。连接密度(Conn.D)和骨表面积体积比(BS/BV)同时增加的趋势进一步支持了活跃重塑状态的解释。这种解释与观察结果一致，即黄色模块中的共表达微生物与体高、体重、胸围、骨小梁模式因子、骨表面积和骨体积比，以及肠道钙吸收蛋白呈正相关。Eubacterium ruminantium是一种有益细菌，通过发酵瘤胃中的纤维素和复合碳水化合物产生短链脂肪酸(SCFA)。SCFA(乙酸、丙酸、丁酸)在反刍动物的营养代谢和能量供应中发挥重要作用。它们还有助于肠道健康并增强纤维素降解。此外，黄色模块中核心微生物的识别，突出了有益微生物群在γ-PGA补充后改善骨密度和强度的潜在作用。
大量研究表明，几种益生菌可增强体内钙吸收。值得注意的是，在本研究中，Prevotella不仅是优势菌属，也是青绿色模块的核心微生物。尽管Rikenellaceae RC9 gut group与对照组相比差异不显著，但其丰度在γ-PGA处理水平间存在显著差异，并且它也是青绿色模块的核心类群。青绿色模块与屠宰率、回肠钙浓度和骨CT值呈正相关，与第60天的饲料效率、第30天的干物质采食量和十二指肠绒毛长度呈负相关。Prevotella以代谢复杂营养素(如纤维素和蛋白质)而闻名，并与其他微生物协同作用以促进宿主生长发育。基于十二指肠组织学和电镜结果，过量的γ-PGA对肠道结构无益。综合考虑所有指标，我们建议1.2 g/(d·头)作为γ-PGA的推荐补充剂量。然而，本研究仅是一个起点。需要进一步研究以确定γ-PGA的最佳分子量范围、其精确吸收率以及其在反刍动物独特胃肠道环境中的钙螯合模式，这将需要涉及同位素示踪技术的研究。
本研究存在几个局限性。首先，每组6只动物的样本量，虽然与之前的反刍动物研究一致，但可能限制了检测微妙表型差异的统计效力，并可能影响WOCNA等基于网络分析的稳健性。其次，屠宰后取样的横断面性质无法评估骨重塑随时间的动态变化。第三，虽然我们已经确定了特定微生物类群与宿主表型之间的强相关性，但这些关联并未建立因果关系。未来的研究应采用更大的样本量、纵向取样以及干预方法(如粪便微生物群移植或限菌动物模型)，以验证所识别的核心微生物在介导γ-PGA对钙代谢和骨骼健康影响中的因果作用。
4. 材料与方法
4.1. 动物伦理声明
本研究获得内蒙古农牧业科学院动物伦理委员会批准(批准号[2024-0017])。所有涉及动物的程序均严格按照委员会关于实验室动物护理和使用的指南进行。
4.2. 实验设计、动物和日粮
共有24只健康的雄性苏尼特羔羊(5-6月龄；初始体重27.49 ± 3.68 kg)用于这项为期60天的实验。经过10天的适应期后，将羔羊随机分配到四个日粮处理组(每组n=6)。对照组(C): 基础日粮；低γ-PGA组(L): 基础日粮 + 0.6 g/(d·头)γ-PGA；中γ-PGA组(M): 基础日粮 + 1.2 g/(d·头)γ-PGA；高γ-PGA组(H): 基础日粮 + 2.4 g/(d·头)γ-PGA。
