钠钾ATP酶α4亚型（NKAα4）调控离子稳态在小鼠精子顶体反应中的关键作用及机制探究

《International Journal of Molecular Sciences》：Astroglial and Neuronal Injury Markers (GFAP, UCHL-1, NfL, Tau, S100B) as Diagnostic and Prognostic Biomarkers in PTSD and Neurological Disorders Ewa Alicja Og?odek and Michal Bar

本综述聚焦于睾特异的钠钾ATP酶α4亚型（NKAα4）在精子功能中的核心作用。通过基因敲除与药理学抑制等综合手段，研究揭示了NKAα4及其同工酶NKAα1共同参与调控精子顶体反应（AR），并通过维持细胞内钠（Na+）、钾（K+）、钙（Ca2+）离子稳态对此过程发挥关键控制，这为理解精子生理性异常所致的男性不育机制提供了新视角。

　　

引言

钠钾ATP酶（NKA）作为一种活跃的离子转运系统，广泛表达于绝大多数动物细胞表面，其核心功能是通过水解ATP提供的能量，将细胞内的Na⁺泵出，同时将细胞外的K⁺泵入，从而建立并维持跨膜Na⁺、K⁺梯度。该离子梯度对维持细胞渗透压平衡、静息膜电位以及其他离子和水分的次级转运至关重要。NKA由催化的α亚基和糖基化的β亚基构成，其中α亚基主要负责离子结合、封闭和跨膜转运，同时也是特异性抑制剂乌本箭毒苷（ouabain）的作用靶点。在哺乳动物细胞中，NKA的α亚基存在四种亚型（NKAα1-α4）。其中，NKAα4是唯一的睾丸特异性亚型，仅在雄性生殖细胞和成熟精子中表达，而其余三种亚型（NKAα1, α2, α3）则在全身各组织和细胞中特异性表达。此前的研究已明确NKAα4在精子运动（运动学）和男性生育力中扮演不可或缺的角色，其缺失或抑制会导致精子运动缺陷和雄性不育。然而，NKAα4及其普遍表达的“同僚”NKAα1在精子另一关键生理过程——顶体反应（AR）中的作用，尚不清楚。AR是精子与卵子相遇前发生的一个关键性胞吐事件，涉及精子顶体膜与细胞质膜的融合以及顶体内水解酶的释放，对精子穿透卵丘细胞和透明带、最终实现受精至关重要。考虑到NKA活性与AR的相关性已被前人提及，本文旨在探究NKAα4与NKAα1在精子AR中的具体贡献，并深入解析其调控所依赖的离子机制，特别是Na⁺、K⁺、Ca²⁺的作用。

结果

为探究NKAα4在精子AR中的作用，研究者采用遗传学与药理学相结合的策略。遗传学模型是先前构建的NKAα4基因敲除（NKAα4-KO）小鼠，药理学则利用NKAα1与NKAα4对乌本箭毒苷亲和力的显著差异（NKAα4对乌本箭毒苷高度敏感，IC₅₀约为1 nM；而NKAα1对其相对不敏感，IC₅₀约为1 μM），从而实现对不同亚型的选择性抑制。

-6 M和10^-3M乌本箭毒苷的情况下测定。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示（n = 3）。"> 实验发现，在获能（Cap）培养基中，低浓度乌本箭毒苷（10^-6M，选择性抑制NKAα4）处理可显著降低野生型（WT）精子的AR，而高浓度乌本箭毒苷（10^-3M，同时抑制NKAα4和NKAα1）则能进一步抑制AR，使其降至非获能（NC）培养基中的基础水平。这表明NKAα4和NKAα1均参与调节精子AR，且两者的贡献大致相当。

然而，NKAα4-KO精子的表现却出人意料。即使在非获能条件下，NKAα4-KO精子也显示出异常高的AR水平，大约是WT精子的两倍。在获能培养基中，其AR水平更高。乌本箭毒苷处理对NKAα4-KO精子的AR无显著影响。这种NKAα4缺失引发的异常高AR，并非由于顶体囊泡发育不全或分化早期提前释放所致。电子显微镜观察和顶体标记物染色证实，直接从附睾尾部获取的NKAα4-KO精子顶体结构完好，形态正常。但当这些精子被置于NC培养基中处理后，即表现出明显的顶体丢失。这表明NKAα4-KO精子在接触培养基后无法维持离子稳态，从而触发了异常的、提前的AR。

鉴于NKA的主要功能是排出Na⁺，NKAα4-KO精子存在包括细胞内Na⁺和Ca²⁺浓度升高在内的多种离子失衡缺陷。为了解这些离子如何影响AR，研究者系统分析了Na⁺、K⁺、Ca²⁺的作用。

钠离子（Na⁺）的作用

实验表明，无论是WT还是NKAα4-KO精子，培养基中去除Na⁺均会抑制AR的发生。对于WT精子，Na⁺的存在是Cap培养基中诱导AR所必需的。而对于本就处于高AR状态的NKAα4-KO精子，去除培养基中的Na⁺可使其AR降至WT基础水平。使用Na⁺离子载体莫能菌素（monensin）处理WT精子，即使是在非获能条件下也能增强AR，模拟了NKAα4-KO精子的高Na⁺状态。然而，莫能菌素对已处于高细胞内Na⁺水平的NKAα4-KO精子AR无进一步影响。利用CoroNa Green荧光探针检测证实，NKAα4-KO精子在含Na⁺培养基中的细胞内Na⁺水平显著高于WT精子。

+的NC或Cap培养基中，或经10 μM莫能菌素预处理后，测定AR。（C）使用CoroNa Green测量WT和NKAα4-KO精子在有或无NaCl、有或无尼日利亚菌素（nigericin）条件下的细胞内Na⁺水平。"> 这些结果共同表明，细胞内适当的Na⁺浓度是精子AR正常发生所必需的，而NKAα4-KO精子由于无法有效排出Na⁺导致的高Na⁺内环境，是其异常高AR的关键诱因之一。

钾离子（K⁺）的作用

去除培养基中的K⁺同样能抑制WT和NKAα4-KO精子的AR。在Cap培养基中，K⁺的存在对WT精子AR至关重要。对于NKAα4-KO精子，去除K⁺可将其在非获能和获能条件下的高AR降至低水平。K⁺离子载体缬氨霉素（valinomycin，促进K⁺外流，降低细胞内K⁺）处理，能够降低WT精子在获能条件下的AR，并显著降低NKAα4-KO精子在非获能和获能条件下的AR。利用PBFI AM荧光探针检测发现，NKAα4-KO精子细胞内K⁺水平低于WT精子，反映了NKAα4缺失导致的K⁺摄取减少。当培养基中同时去除Na⁺和K⁺时，对AR的抑制效应与单独去除任一种离子时相当，并未出现叠加效应，进一步印证了这两种离子在支持AR中的重要性。

+（4.7 mM）的NC或Cap培养基中；（B）在含有K⁺并经10 μM缬氨霉素（valinomycin）预处理的培养基中。（C）使用PBFI AM测量WT和NKAα4-KO精子在有或无KCl、有或无缬氨霉素条件下的细胞内K⁺水平。">

钙离子（Ca²⁺）的核心作用

Ca²⁺是已知的AR关键触发因子。本研究发现，去除培养基中的Ca²⁺可完全抑制WT精子在获能条件下的AR，并可将NKAα4-KO精子的异常高AR降至基础水平。先前研究已证实NKAα4-KO精子存在细胞内Ca²⁺水平异常升高，这可能是其过早发生AR的主要驱动力。Ca²⁺离子载体A23187的实验进一步凸显了Ca²⁺的核心地位：即使在培养基中缺乏Na⁺和K⁺的情况下，A23187也能部分恢复WT精子的AR。这表明，虽然Na⁺和K⁺对支持AR很重要，但Ca²⁺的流入在触发AR中起着更为主导和核心的作用。利用Fluo-4 AM荧光探针检测确认，NKAα4-KO精子在含Ca²⁺培养基中的细胞内Ca²⁺水平略高于WT精子，且A23187能更显著地提升NKAα4-KO精子内的Ca²⁺。

+和K⁺对WT或NKAα4-KO小鼠精子AR的影响。"> 2+对WT和NKAα4-KO小鼠精子在NC或Cap培养基中顶体反应的影响。（B）Ca²⁺离子载体A23187对WT和NKAα4-KO小鼠精子在有或无Na⁺和K⁺时AR的影响。（C）使用Fluo-4 AM测量WT和NKAα4-KO小鼠精子在有或无CaCl₂、有或无A23187条件下的细胞内Ca²⁺水平。">

讨论

本研究首次系统阐明了NKAα4在精子顶体反应（AR）中的关键作用，并揭示了其通过调控Na⁺、K⁺、Ca²⁺离子稳态来影响AR的分子机制。与之前发现的NKAα4在精子运动中的主导作用不同，本研究发现NKAα4及其“伙伴”NKAα1在调节AR中扮演着几乎同等重要的角色。NKAα4对Na⁺具有更高的亲和力，能维持更陡峭的跨膜Na⁺梯度，这对于依赖离子快速变化的精子鞭毛运动或许更为关键；而在AR调控中，NKAα1维持的较低梯度和NKAα4的功能似乎可以相互补充。

NKAα4-KO精子表现出异常高的自发AR，这一表型令人意外，但可从其长期的离子失衡得到解释。NKAα4的缺失导致其直接调控的Na⁺、K⁺水平紊乱，并间接影响了通过Na⁺/Ca²⁺交换体调控的细胞内Ca²⁺浓度，导致细胞质膜去极化。这种慢性的、不可逆的离子稳态破坏，使得NKAα4-KO精子在面对培养基离子环境变化时无力应对，从而触发了不受控制的、过早的AR。这种过早的AR，连同已知的运动缺陷，共同解释了NKAα4-KO雄性小鼠不育的深层原因——在正确的时间和地点（即接近卵子时）完成AR对受精至关重要，过早释放顶体内容物会使精子在与卵子相遇时丧失穿透能力。

实验数据清晰地勾勒出NKAα4通过控制离子稳态影响AR的路径：NKAα4通过泵出Na⁺维持胞内低Na⁺环境，这一Na⁺梯度为Na⁺/Ca²⁺交换体提供驱动力，从而调控胞内Ca²⁺水平。NKAα4的缺失导致Na⁺内流、Na⁺/Ca²⁺交换反向，最终导致Ca²⁺累积。同时，NKAα4也参与维持K⁺内流和膜电位。Na⁺、K⁺的紊乱影响膜电位，而膜电位的变化又调控着CatSper等关键Ca²⁺通道的活性，进一步影响Ca²⁺内流。在AR的层级调控中，Ca²⁺处于核心位置，其内流是触发AR的最后共同通路之一。Na⁺和K⁺的作用更多在于为Ca²⁺信号的精确调控创造合适的离子环境和膜电位背景。因此，Na⁺或K⁺的缺失会显著抑制AR，而通过A23187直接导入Ca²⁺可以在一定程度上绕过对Na⁺/K⁺的部分需求。NKAα4正是通过这一精密的离子调控网络，确保AR在适当的时机被精确触发。

结论

综上所述，NKAα4不仅是精子运动的“动力调节器”，也是精子顶体反应（AR）的“离子稳态开关”。其功能超越了简单的离子泵，通过直接调控Na⁺、K⁺，并间接影响Ca²⁺，构成了一个精细的离子调控网络。NKAα1虽然也参与AR，但无法替代NKAα4的核心功能。NKAα4的缺失导致离子稳态崩溃，特别是细胞内Ca²⁺的异常升高，进而引发过早的、失控的AR。这项研究揭示了离子稳态在雄性配子功能中的极端重要性，阐明了NKAα4缺陷导致雄性不育的一个新机制——过早的顶体反应，为理解与离子通道/转运体功能障碍相关的男性不育症提供了新的理论基础和潜在干预靶点。未来研究需进一步探索Na⁺、K⁺、Ca²⁺在时间和空间维度上的动态变化如何协同调控精子功能。