《International Journal of Molecular Sciences》：A Novel Heterozygous ARL3 Variant in Non-Syndromic Retinitis Pigmentosa: Clinical and Functional Characterization
Emilia Stellacci,
Lucia Ziccardi,
Alessandro Bruselles,
Carmen Dell’Aquila,
Luca Mignini,
Marcello Niceta,
Luigi Chiriatti,
Mattia Carvetta,
Erika Zara and
Viviana Cordeddu
+ 5 authors
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本研究报告了一个与常染色体显性非综合征性视网膜色素变性相关的新型ARL3基因杂合错义变体c.199G>C (p.Asp67His)。在一个四代家系中，该变体表现出不完全外显和显著的表型异质性。功能研究发现，该变体导致ARL3蛋白稳定性降低、GTP酶活性受损，并引起患者来源成纤维细胞初级纤毛数量减少和长度异常。研究表明，ARL3功能障碍导致的纤毛运输缺陷是视网膜变性的核心机制。这项工作强调了分子诊断与功能验证相结合的重要性，为理解ARL3相关疾病的复杂基因型-表型关系提供了新见解。
引言
遗传性视网膜营养不良（IRD）是一组以感光细胞进行性功能障碍和结构丧失为特征的基因异质性退行性疾病。视网膜色素变性（RP）是IRD中最常见的形式，全球患病率约为1/4000，可呈常染色体显性、隐性或X连锁遗传。超过85个基因与RP发病相关，其中ADP-核糖基化因子样3（ARL3）基因编码一种小GTP结合蛋白，是调节感光细胞生物学的关键因子。ARL3在调节脂质修饰蛋白向感光细胞外段的运输中起关键作用，这一过程对维持感光细胞结构和功能至关重要。ARL3主要定位于感光细胞内段肌样区的连接纤毛，并被纤毛特异性蛋白ARL13B（作为鸟嘌呤核苷酸交换因子GEF）激活。ARL3的失活则由视网膜色素变性2（RP2）蛋白介导，该蛋白作为GTP酶激活蛋白（GAP），定位于前纤毛区室，从而确保ARL3-GTP在纤毛内的空间控制。该通路的破坏会损害纤毛完整性并最终导致视网膜变性。ARL3的纯合和杂合变异均与原发性纤毛病和视网膜退行性疾病相关。
本研究报道了通过多模态临床评估、基因检测和功能验证，解决了一名患有晚期非综合征性RP的55岁女性（先证者）诊断困境的结果。先证者此前通过标准二代测序基因panel检测未能获得明确分子诊断。对先证者和一名患病舅舅进行的全基因组测序鉴定出一个新型杂合错义变体c.199G>C (p.Asp67His)。对该四代家系14名成员进行的共分离分析显示，9名个体携带该变体。值得注意的是，临床表现高度异质，有不完全外显和可变表达度的证据，表明存在复杂的基因型-表型关系。通过整合临床评估、计算机致病性预测、结构建模和功能分析，本研究探究了该变体的致病作用，并为ARL3相关视网膜疾病机制提供了见解。
结果
病例介绍
本研究评估了一个四代家系，其成员表现出异质性的视网膜表型谱。收集了9名携带相同ARL3基因变体但表现出非综合征性视网膜特征的成员的临床眼科病史和多模态眼科评估数据。作为观察到的这种具有不完全外显的常染色体显性视网膜营养不良表型异质性的代表性例子，报告了四种不同的表型：先证者（III.16）的伴有早期黄斑萎缩的晚期RP、先证者儿子（IV.7）的早期RP、先证者堂兄（III.7）的中央周围RP，以及先证者另一堂兄（III.2）的无症状表型。所有受试者均接受了神经学和神经影像学评估，包括脑磁共振成像以排除Joubert综合征的特征性表现。检查的受试者均未出现任何面部畸形或肾脏、呼吸和/或听力异常，证实为孤立性视网膜表型。
先证者（III.16）为55岁女性，26岁时出现夜盲和进行性周边视力丧失，确诊RP。到本中心首次评估时，双眼最佳矫正视力为光感。眼底检查显示动脉变细、视网膜色素变化伴骨细胞样沉积、黄斑萎缩。光谱域光学相干断层扫描显示椭圆体带和外界膜弥漫性破坏。全视野暗适应视网膜电图波形严重异常。先证者儿子（IV.7），24岁男性，19岁起出现夜盲症。最佳矫正视力右眼20/32，左眼20/20。超广角眼底照相显示轻微视网膜营养不良迹象。SD-OCT显示中心凹旁区域外视网膜椭圆体带破坏。暗适应全视野视网膜电图显示a波和b波振幅降低。先证者堂兄（III.7），65岁男性，无症状。最佳矫正视力20/20。自动视野检查显示周边区和中心区敏感性降低。超广角眼底照相显示中心凹周围环形视网膜营养不良。SD-OCT显示中心凹及中心凹旁区域视网膜下高反射物质融合性积聚。多焦视网膜电图显示第二和第三环振幅值处于正常下限。先证者另一堂兄（III.2），52岁男性，无眼部症状和体征。所有形态和功能评估均在正常范围内。
在该家系中观察到的广泛视网膜受累谱，从无检测到的疾病到中度轻度视网膜营养不良和晚期RP，表明与该ARL3变体相关的表型异质性，并支持不完全外显。值得注意的是，缺乏临床表现与年龄无关。
基因组分析
由于在先证者中使用针对IRD的靶向基因panel进行的常规二代测序诊断没有定论，因此对先证者及其患病舅舅进行了全基因组测序。该分析揭示了ARL3中的一个杂合错义变体（NM_004311.4:c.199G>C），预测会导致p.Asp67His氨基酸替换。该受影响残基在直系同源物中高度保守，根据结构建模，位于ARL3的催化结构域内。计算机致病性预测支持该变体的有害效应。基于ACMG/AMP标准，在缺乏功能证据或明确基因型-表型相关性的情况下，该变体被归类为可能致病。使用Sanger测序的分离分析证实了该变体存在于三个被分析世代的9名家庭成员中。如上所述，观察到了显著的家系内表型变异性，一些变体携带者表现出视网膜损伤，而另一些则没有视网膜变性的体征和症状。
功能验证分析
ARL3包含六个外显子，编码一个182个氨基酸的蛋白质。已鉴定出的错义变体影响了Asp67残基，该残基最近被报道在突变时会导致ARL3的组成性活性，引起常染色体显性非综合征性杆锥细胞营养不良。由于Asp67残基位于催化结构域内，本研究使用分子建模方法研究了其结构作用以及p.Asp67His替换的功能影响。位于GDP/GTP结合位点核心的Asp67是一个极性带负电荷的残基，在通过氢键网络维持正确的口袋形成和稳定核苷酸结合方面起关键作用。第67位密码子的天冬氨酸到组氨酸的替换引入了一个具有不同化学性质、在生理pH下主要为中性侧链的更大残基。预计这种变化会导致局部结构重排并破坏结合口袋内的静电相互作用，从而可能降低GTP结合。进一步探索这一假设，进行了ΔΔG分析以评估p.Asp67His替换的热力学影响，并与先前报道的p.Asp67Val变体以及所有已知的良性和致病性ARL3错义变体进行比较。计算得出的p.Asp67His变化的ΔΔG值为4.955 kcal·mol-1，代表对蛋白质折叠的失稳效应，并可能降低GTP-ARL3结合亲和力。相比之下，p.Asp67Val替换产生的ΔΔG为-2.31 kcal·mol-1，表明相对于野生型蛋白质，蛋白质稳定性增加，GTP-ARL3结合亲和力可能增强。这些发现表明His67和Val67替换对蛋白质折叠和稳定性有相反的影响。
为了评估p.Asp67His变体的功能后果，构建了编码野生型ARL3和p.Asp67His突变体以及携带先前报道的致病性变体p.Asp67Val、p.Arg99Ile和p.Tyr90Cys的构建体。将构建体瞬时转染到培养的HEK293T细胞后，进行蛋白质印迹分析以评估蛋白质表达水平。与野生型蛋白质相比，突变体ARL3蛋白表现出显著降低的稳定性；然而，用蛋白酶体抑制剂MG132处理可恢复所有突变体蛋白的表达水平，表明这些替换导致了加速的蛋白酶体降解。
为了评估突变对GTP酶活性的影响，使用亲和沉淀实验评估了转染的HEK293T细胞中外源性活性ARL3-GTP的水平。在表达突变体蛋白的细胞中几乎检测不到ARL3-GTP水平，这与蛋白质印迹观察到的蛋白质水平降低一致。为了克服这一限制，在MG132处理后重复了ARL3激活实验。处理六小时后，突变体水平部分恢复，允许在表达突变体的细胞中检测到ARL3-GTP。值得注意的是，p.Asp67Val突变体表现出ARL3-GTP的显著增加。当ARL3-GTP水平相对于总ARL3表达进行归一化时，这些数据证实了p.Arg67Val变体的过度活跃行为，而表达p.Arg67His的细胞则显示激活减少。
鉴于Asp67His替换的致病相关性以及ARL3在向感光细胞外段进行纤毛运输中的重要作用，对来自先证者的原代成纤维细胞进行了共聚焦显微镜检查，以评估纤毛形态和丰度。与对照细胞相比，携带杂合ARL3变体的成纤维细胞初级纤毛数量显著减少。此外，患者来源的成纤维细胞中的纤毛明显长于对照细胞中观察到的纤毛。
最后，考虑到在该家系中观察到的不完全外显，本研究调查了差异ARL3表达是否可能有助于变体携带者之间的表型变异性。通过RT-qPCR量化了受影响个体和未受影响携带者中的ARL3 mRNA水平，以包含该变体的cDNA区域为目标，使用对照样本作为参考。受影响个体的ARL3 mRNA水平降低，而未受影响携带者的表达水平与对照组相当。这些数据表明，无症状携带者中保留的ARL3表达可能部分补偿了该变体的致病效应，而受影响个体中降低的水平可能有助于疾病表现。
讨论
本研究中新型杂合错义变体p.Asp67His的鉴定加强了ARL3功能障碍参与IRD的证据。Asp67残基位于ARL3的催化结构域内，并且在物种间高度保守。先前对附近残基的研究表明，该位点的扰动可以改变GTP酶循环并破坏ARL3活性的纤毛梯度，显性变体（如p.Asp67Val和p.Tyr90Cys）在体内产生过度活跃或快速循环的ARL3和异常的纤毛梯度。尽管p.Asp67His在化学性质上与p.Asp67Val不同，但结构建模表明，该残基的变化预计会扰乱ARL3的催化功能，从而影响下游货物的释放。与这一模型一致，ARL3功能的扰动导致小鼠模型中纤毛发生和感光细胞维持的缺陷，强调了该蛋白在鞭毛内运输和脂化货物运输中的双重功能。
对患者来源成纤维细胞的共聚焦分析表明，初级纤毛频率的降低伴随着纤毛长度的增加。纤毛长度的改变已知会影响纤毛介导的信号传导和细胞行为，多个系统的研究表明，初级纤毛的伸长和缩短，通常由微管或肌动蛋白重塑驱动，会显著影响下游通路输出。同时，体外表达分析表明，Asp67His替换使ARL3失稳，导致稳态蛋白质水平降低，而蛋白酶体抑制可恢复这些水平。这些发现意味着加速的蛋白酶体降解是另一个致病机制。蛋白酶体介导的调节越来越被认为是控制小GTPase和工程或突变蛋白的关键层面；用蛋白酶体抑制剂进行的拯救反映了先前在其他蛋白质系统中证明的蛋白酶体依赖性稳定作用，支持了泛素-蛋白酶体途径在缓冲错误折叠或不稳定变体中的普遍作用。综上所述，这些数据表明，Asp67His变体通过催化扰动和蛋白质稳定性降低的组合发挥致病作用，从而限制了ARL3在纤毛基部的可用性，并损害了纤毛发生和感光细胞维持。
已经描述了几种显性ARL3等位基因，包括p.Asp67Val和p.Tyr90Cys，它们与非综合征性视网膜变性相关，并且通常表现出完全外显，尽管表达度可变。相比之下，目前鉴定出的p.Asp67His显示出不完全外显，既有有症状的受影响成员，也有一些无症状的携带者缺乏视觉异常和视网膜形态功能变化。这种显著的家系内变异性表明，遗传或环境修饰因子可能缓冲了这种替换的表型后果。
剂量敏感性是常染色体显性视网膜基因的一个公认特征，最近的研究强调了具有相同ARL3变体的个体之间可变的ARL3表达度。视网膜干细胞模型将缺陷性脂化蛋白运输归因于这种变异性的共同机制。更广泛地说，单基因疾病中的不完全外显和可变表达度通常由遗传修饰因子、调控变体、表观遗传因素和环境影响之间的复杂相互作用驱动。值得注意的是，本研究观察到受影响个体中ARL3 mRNA水平降低，而无症状携带者水平正常。这些发现并非反映了代偿反应，而是指出了可能加剧失稳变体功能影响的转录缺陷。这种差异可能源于调控元件（包括启动子或增强子）的变异，或表观遗传修饰（如差异性DNA甲基化），最终导致尽管存在相同的致病等位基因，但产生不同的转录输出。
在ARL3相关疾病中观察到的表型谱与显性PRPH2突变所见的相似，范围从图案样营养不良和成人发病的黄斑营养不良到晚期RP，通常在同一家系内，偶尔伴有外显率降低。更广泛的病例系列和队列研究继续将修饰单倍型和遗传背景作为这些疾病严重程度和外显率的主要决定因素。具有异质疾病表达度的可变变体外显率也见于另一种常见的常染色体显性基因相关IRD，BEST1。这些相似之处共同强调了常染色体显性视网膜疾病的一个更广泛发现，其中剂量敏感性和遗传背景至关重要地塑造了临床结果。
材料与方法
患者样本
本研究在罗马高等卫生研究所内进行，旨在调查未确诊的视网膜疾病患者。所有程序均遵守《赫尔辛基宣言》（1964年及后续修订版）的原则。所有参加研究的个体均签署了同意书。
眼科评估
家系谱中的9名成员接受了全面的眼科评估，包括形态和功能评估。评估包括最佳矫正视力、近视力、色觉、前段裂隙灯检查、眼压测量、功能评估包括动态视野检查、自动视野检查、暗适应和明适应全视野视网膜电图、多焦视网膜电图以及形态学视网膜成像，包括超广角眼底照相、超广角眼底自发荧光、光谱域光学相干断层扫描。
全基因组测序
对先证者及其亲属进行了全基因组测序。使用Sentieon进行读取映射、小变体和联合基因型 calling。使用GATK进行SNP和InDel硬过滤。使用自定义流程对检测到的高质量变体进行注释和过滤。
基因组DNA和RT-qPCR分析
使用基因组DNA验证先证者和父母血液中的错义变体。提取总RNA并反转录为cDNA。使用SYBR Green Master Mix和QuantStudio 3实时PCR系统进行RT-qPCR。使用HPRT1作为内参对mRNA水平进行归一化。使用2-ΔΔCT方法计算ARL3的相对量。
结构和折叠自由能计算分析
使用分子建模方法进行结构分析，采用UCSF Chimera可视化软件。使用野生型ARL3模型研究Asp67的结构相关性和第67位密码子两种ARL3错义变化的功能后果。进行折叠自由能分析以研究p.Asp67His变化以及所有先前报道的良性和致病性ARL3错义变体的热力学影响。使用FoldX Suite进行计算。
DNA克隆和诱变
将人ARL3的编码序列克隆到pcDNA6-V5载体中。通过定点诱变将错义突变引入野生型ARL3。
细胞培养和体外研究
培养先证者和健康供体的原代皮肤成纤维细胞以及HEK293T细胞系。用野生型和突变体表达载体瞬时转染HEK293T细胞。用MG132处理细胞，然后裂解。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析蛋白质表达。
ARL3激活实验
将HEK-293T细胞接种在培养皿中，用野生型或突变体V5标记的ARL3突变体表达构建体转染。用MG132处理细胞或不做处理。收集细胞并进行裂解。裂解物进行亲和沉淀，添加抗ARL3-GTP抗体和蛋白A/G琼脂糖珠浆。洗涤珠子，沉淀的蛋白质和全细胞裂解物与还原性SDS-PAGE上样缓冲液合并，变性，通过SDS-PAGE分离，并在PVDF膜上进行免疫印迹。
共聚焦激光扫描显微镜
将原代皮肤成纤维细胞接种在玻璃盖玻片上，在完全培养基中培养24小时。饥饿30小时后，用4%多聚甲醛固定亚汇合成纤维细胞。随后，用一抗和二抗对细胞进行染色。染色后，将盖玻片充分冲洗并安装到显微镜载玻片上。在Zeiss LSM980上进行分析。
统计分析
使用标准方法进行所有统计分析以评估数据显著性和变异性。连续变量报告为平均值±标准差。使用独立样本t检验评估两组之间的差异。对于涉及两组以上的比较，应用单因素方差分析，然后进行Dunnett多重检验校正。统计学显著性定义为t检验p < 0.01，方差分析p < 0.05。
结论
p.Asp67His对ARL3功能的破坏性作用似乎是通过损害纤毛发生实现的。与先前报道的显性ARL3变体不同的不完全外显的观察，突出了剂量效应和修饰因子在塑造常染色体显性视网膜疾病表达中的影响。通过整合分子建模、基于细胞的纤毛表型分析和表达分析，本研究支持一个模型，其中变体特异性扰动ARL3循环导致感光细胞功能障碍，遗传背景影响疾病风险和严重程度。这些发现推动着使用人类视网膜模型进行进一步研究，并支持开发针对蛋白质稳定性、纤毛调节和基因表达调控的治疗策略。
