综述：巨噬胞外囊泡：罕见病角膜纤维化的治疗策略

《Biomolecules》：Macrophage Extracellular Vesicles: Therapeutic Strategies for Corneal Fibrosis in Rare Diseases Haiming Li, Anne-Sophie Loewinger, Danial Roshandel, Yuan Fang, Jingjing You, Mark Daniell and Gink N. Yang

本文系统性地阐述了罕见病角膜纤维化的病理机制，并重点探讨了以巨噬胞外囊泡为代表的新型疗法。文章指出，巨噬胞外囊泡凭借其免疫调节特性，能多通路协同作用，有望克服传统单靶点药物的局限，为棘手的罕见病角膜纤维化治疗提供了新思路。综述涵盖了从角膜炎症、神经免疫互作到EV合成与递送等关键环节，是生物医学与临床转化研究者的重要参考资料。

　　

1. 引言

角膜是维持视觉透明的关键组织，其透明性的破坏，即角膜纤维化，是全球范围内主要的致盲原因之一。这种瘢痕形成过程不仅见于常见的眼外伤或感染，在罕见遗传病如大疱性表皮松解症、角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征和无虹膜症中也普遍存在。在罕见病中，纤维化由慢性炎症、结构不稳定和神经免疫功能障碍共同驱动，而现有疗法往往因疗效有限或副作用显著而难以满足患者需求。因此，开发新型治疗策略迫在眉睫。

胞外囊泡，作为一种由多种细胞（如间充质干细胞）分泌的天然纳米颗粒，凭借其高生物相容性和多靶点协同作用的能力，展现出抑制角膜纤维化的巨大潜力。其中，具有免疫调节特性的巨噬胞外囊泡，为罕见病角膜纤维化的治疗提供了独特的思路。

2. 免疫反应、巨噬细胞和神经在角膜纤维化中的作用

2.1. 导致纤维化的角膜炎症

角膜纤维化通常始于上皮损伤或上皮基底膜（EBM）缺陷。健康的EBM可抑制转化生长因子-β等促纤维化分子的扩散，而当其受损时，这些信号便会持续暴露于基质中，激活静息的角膜基质细胞，使其分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，并产生异常的细胞外基质，最终导致角膜浑浊。这一过程涉及多种细胞因子和生长因子，如TGF-β、血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子。

2.2. 巨噬细胞在角膜纤维化中的作用

巨噬细胞是参与组织损伤启动、维持和消退的大型多功能免疫细胞。在组织修复和纤维化过程中，巨噬细胞发挥着清除碎片、维持组织稳态、募集成纤维细胞并刺激角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化等关键功能。

巨噬细胞表现出不同的极化表型，具有不同的免疫调节特性：

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  M1型巨噬细胞：经脂多糖和干扰素-γ诱导，属于促炎表型，通过释放白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子，清除伤口处的病原体。
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  M2型巨噬细胞：经白细胞介素-4、白细胞介素-10等诱导，属于抗炎表型，与组织修复过程相关，通过细胞外基质重塑和释放白细胞介素-10、转化生长因子-β等因子发挥作用。
  巨噬细胞在不同表型间具有可塑性，可根据组织微环境中的细胞因子信号进行转换。

2.3. 角膜神经在角膜纤维化中的作用

角膜是人体神经支配最密集的组织。角膜神经纤维通过释放神经肽（如P物质、降钙素基因相关肽）与免疫细胞通讯，维持眼表免疫平衡。炎症发生时，角膜神经释放的P物质可诱导角膜基质细胞收缩，刺激I、II、V型胶原分泌，并上调α-平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白，从而促进基质细胞向促纤维化的肌成纤维细胞表型转变，最终加剧纤维化。在罕见眼表疾病中，持续的上皮破坏和慢性炎症会导致角膜神经损伤，从而形成损伤与异常修复的恶性循环。

3. 罕见疾病中的角膜纤维化

3.1. 罕见疾病与大疱性表皮松解症

罕见病的角膜纤维化常源于遗传异常导致的慢性自身免疫反应和结构蛋白缺陷。其中，大疱性表皮松解症是导致角膜纤维化的重要罕见病。在交界性大疱性表皮松解症中，编码层粘连蛋白-332的基因发生突变，导致该蛋白缺失或功能障碍，削弱了上皮与基底膜的附着。在营养不良性大疱性表皮松解症中，VII型胶原的缺陷则导致上皮-基质附着不稳。反复的损伤使基底膜被慢性破坏，延长了促纤维化信号在基质中的暴露，逐渐将角膜推向纤维化进程。

3.2. 针对罕见病的治疗开发考量

罕见病导致的角膜纤维化为治疗开发带来了独特挑战，主要包括：眼表动态环境导致的药物滞留时间短、疾病本身的脆弱性和异质性、基因疗法的高成本与复杂性、小批量生产的制造难题、临床前模型构建困难以及临床试验设计复杂。这些挑战在图1中进行了总结。

3.3. 罕见疾病的当前眼部治疗与药物递送选择

对于以大疱性表皮松解症为代表的罕见角膜病患者，当前治疗仍以支持性方法为主，主要目标是减少机械摩擦、稳定眼表、尽可能抑制炎症和继发感染。最常见的是润滑剂，但效果短暂。此外，还有抗生素、局部皮质类固醇和非甾体抗炎药等。有研究表明，含有人羊膜的滴眼液因其含有层粘连蛋白-332，具有抗炎和抗纤维化作用，可缓解交界性大疱性表皮松解症儿童的眼部症状。手术方法，如角膜移植，在某些罕见病中效果有限且风险较高。

3.4. 罕见疾病的药物递送选择

由于罕见病患者眼部结构脆弱，高效的递送方法尤为重要。近年来，包括水凝胶和纳米颗粒在内的先进药物递送系统被应用于眼部。这些系统可以增加药物粘附、延长滞留时间或提供缓释，减轻每日治疗负担。特别是，源自细胞的纳米载体因其天然生物相容性和多功能信号传导能力，已显示出治疗潜力。

4. 用于角膜纤维化的胞外囊泡

4.1. 胞外囊泡在角膜伤口愈合中的作用

胞外囊泡主要包括外泌体、微囊泡和凋亡小体三类。其中，外泌体因其尺寸小、膜稳定性好和生物活性成分丰富，在精准医学中受到越来越多的关注。角膜纤维化是一个由炎症介导、多通路调控的复杂过程，传统的单靶点药物难以同时应对所有纤维化信号。而胞外囊泡作为包含微小核糖核酸、蛋白质等多种成分的天然载体，可同时作用于多个通路，在调节炎症和纤维化微环境中发挥重要作用。

4.2. 用于角膜纤维化的特定胞外囊泡

从生物学角度看，所有胞外囊泡都是细胞分泌的脂质双分子层囊泡，但并非所有类型都适用于角膜纤维化治疗。大多数眼科和角膜研究主要使用富含外泌体的小型胞外囊泡组分，其直径约为50-150纳米。基于角膜解剖学和递送途径，小尺寸胞外囊泡能在角膜各层分布更均匀，并更容易被关键细胞摄取。图2说明了在角膜纤维化研究中优先使用小型胞外囊泡的生物学和解剖学考量。

不同细胞来源的胞外囊泡在功能上也存在差异。间充质干细胞来源的胞外囊泡在多种角膜疾病模型中显示出抗炎、促上皮修复和抗纤维化的作用。角膜基质干细胞来源的胞外囊泡也显示出治疗潜力，其抗纤维化能力与微小核糖核酸-29a和-381有关。尽管当前角膜纤维化研究中，巨噬细胞主要作为治疗效果的响应者，但直接使用巨噬胞外囊泡作为治疗工具也值得探索。

5. 巨噬胞外囊泡与外泌体

5.1. 巨噬胞外囊泡与外泌体的类型

巨噬胞外囊泡，特别是外泌体，其功能正逐渐从被视为细胞废物转变为关键的免疫调节介质。巨噬胞外囊泡的货物反映了巨噬细胞高度多样化的激活状态、功能特化和动态细胞周期。巨噬细胞的极化受不同细胞周期阶段的影响，G₁期细胞倾向于促炎反应，而S/G₂/M期细胞则表现出更多抗炎特征。IL-4驱动的S/G₂/M偏向的巨噬胞外囊泡富含抗炎和再生因子，为调节过度免疫反应和异常组织重塑提供了潜在策略。

巨噬胞外囊泡已在多种器官系统的纤维化发病机制中被报道。巨噬胞外囊泡的功能影响与巨噬细胞极化密切相关，如图3所示。在体内外模型中，来自巨噬细胞的外泌体可携带微小核糖核酸-204-5p，并通过抑制FOXC1相关通路，减少胶原沉积和纤维化标志物。在角膜纤维化研究中，巨噬胞外囊泡也显示出潜力。

5.2. 胞外囊泡的合成与表征

巨噬胞外囊泡和外泌体的分离与表征需要仔细考虑生物学和方法学变量，以确保可重复性和功能相关性。定义巨噬细胞来源、分化和极化方案至关重要。尽管文献中描述了多种分离和分析巨噬胞外囊泡的方法，但这些方法的标准化仍有必要。超速离心是胞外囊泡分离的主要方法，但也可能导致其他非外泌体成分的共分离。密度梯度离心、过滤、尺寸排阻色谱以及顺序或组合方法也常用于巨噬胞外囊泡的分离。对于进一步的下游应用，表征分离的巨噬胞外囊泡群体至关重要。

5.3. 巨噬胞外囊泡的潜在递送方法

巨噬胞外囊泡的最佳递送需要在纳米尺度、膜化学和清除动力学方面进行考量，因为这些特性共同影响着囊泡与细胞的相互作用和组织渗透。小型胞外囊泡在作为滴眼剂给药时扩散良好，但由于从眼表快速清除，其内容物的生物利用度较低。基于水凝胶的递送系统，包括水凝胶隐形眼镜，可以帮助延长巨噬胞外囊泡的滞留时间并实现缓释。相比之下，大型胞外囊泡（如微囊泡）虽然携带大量货物，但组织渗透性可能较差。通常绕过屏障的途径（如结膜下注射）更适合这类囊泡群体。囊泡表面特性进一步调节递送效率。例如，具有高度糖基化表面蛋白的胞外囊泡可能会被富含黏蛋白的泪膜截留，降低扩散能力。胞外囊泡的半衰期通常约为2-20分钟，这也限制了局部给药后的滞留，可能需要重复给药。

5.4. 使用巨噬胞外囊泡靶向大疱性表皮松解症相关罕见病

与通常针对特定基因突变、需要个性化生产的基因疗法不同，基于胞外囊泡的疗法可能提供一种更通用的方法。胞外囊泡参与伤口愈合的多个阶段，包括促进止血、调节炎症、诱导细胞增殖和组织重塑。研究表明，胞外囊泡可以通过抑制肌成纤维细胞分化和降解细胞外基质，在各种临床前模型中减轻器官纤维化。此外，胞外囊泡的生产受益于已建立的纯化和工程化方案，支持可扩展的制造。不同胞外囊泡产品共享生产平台可以分摊成本，显著降低最终价格。

既往研究已将巨噬胞外囊泡和巨噬细胞来源的外泌体与大疱性表皮松解症的几个关键临床特征联系起来。例如，巨噬胞外囊泡和巨噬细胞来源的外泌体可通过降低肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的表达、增加微小核糖核酸-222-3p的表达来改善伤口愈合。巨噬胞外囊泡还被证明可以在小鼠模型中诱导巨噬细胞表型从M1型向M2型转换，从而增强血管生成、上皮再生和胶原沉积，最终促进伤口愈合。考虑到大疱性表皮松解症的临床特征，包括反复的表面缺损和慢性炎症，胞外囊泡介导的调节可能为直接靶向功能性伤口修复提供一种有前景的治疗方法。

6. 结论

来自大疱性表皮松解症等罕见病的角膜纤维化，是遗传学、炎症和组织重塑交叉领域尚未满足的临床需求。尽管目前针对罕见纤维化疾病有一些局部治疗选择，但治疗在很大程度上仍是支持性的，凸显了有效治疗的迫切需求。具有高生物相容性和调节关键纤维化信号通路能力的巨噬胞外囊泡，展现出广阔的治疗潜力。然而，在巨噬胞外囊泡疗法有效应用于临床实践之前，仍面临重大挑战。

7. 未来方向

巨噬细胞的可塑性导致其胞外囊泡成分具有高度可变性和环境依赖性，可能递送不需要的促炎性货物。实施细胞周期监测策略，例如使用细胞周期抑制剂或标准化的基于流式细胞术的DNA含量和增殖标志物评估，可以显著降低这种风险，并整体提高巨噬胞外囊泡的质量控制。在巨噬胞外囊泡富集、纯化和表征方面的技术不一致性继续阻碍着研究之间的可比性，强调了标准化方案的重要性。此外，需要进行长期研究以评估巨噬胞外囊泡在人体中的安全性和有效性。