《Biomolecules》：Targeting G9a Exerts Pleiotropic Suppression in Triple-Negative Breast Cancer Cells: Cooperatively Inducing Pyroptosis and Apoptosis
Jialin Li,
Guijuan Zhang,
Tianyang Liu,
Xianxin Yan and
Min Ma
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本研究揭示，通过靶向抑制组蛋白甲基转移酶G9a，能够有效抑制三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并协同诱导细胞凋亡(Apoptosis)和细胞焦亡(Pyroptosis)。其机制涉及激活RIG-I/STAT1/GSDME信号通路。研究结果为TNBC这一侵袭性强、治疗选择有限的乳腺癌亚型提供了新的潜在治疗靶点。
1. 引言
乳腺癌(BC)是女性最常见的癌症，其中三阴性乳腺癌(TNBC)由于缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达，治疗选择有限，预后较差，亟需探索新的治疗靶点。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种新近被充分认识的程序性细胞死亡形式，与多种疾病相关，在肿瘤中扮演着重要角色。细胞焦亡的发生依赖于Gasdermin蛋白家族，其N端片段(GSDM-N)可在细胞膜上形成孔洞，导致细胞内含物大量释放和强烈的炎症免疫反应，最终导致这种裂解性细胞死亡。GSDME是Gasdermin家族成员之一，可被Caspase-3切割，其产生的N端片段(GSDME-N)进而诱导细胞焦亡。在TNBC中，诱导细胞焦亡可增强化疗和放疗的疗效。
G9a，也称为EHMT2，是一种组蛋白3赖氨酸9 (H3K9)甲基转移酶，能够催化H3K9单甲基化(H3K9me1)和双甲基化(H3K9me2)。研究发现G9a可通过H3K9甲基化抑制肿瘤抑制基因，并促进癌基因功能。既往研究表明G9a在多种肿瘤中过表达，包括乳腺癌。在TNBC中，G9a敲低可减少肿瘤生长和转移，提示其可能是一个可行的治疗靶点。然而，G9a在TNBC细胞焦亡中的作用证据仍很有限，其分子机制尚不清楚。
视黄酸诱导基因I (RIG-I)，也称为DDX58，是一种胞内模式识别受体(PRR)，在先天免疫应答中发挥重要作用。先前研究表明，RIG-I可调节与细胞焦亡相关的炎症小体表达，并且在癌症中也扮演重要角色。神经胶质瘤研究证据提示G9a在控制RIG-I方面具有调节作用。
本研究旨在探讨G9a在TNBC细胞中的抗癌作用，重点关注其在细胞焦亡中的角色。我们发现了RIG-I/STAT1/GSDME通路可能是G9a敲低诱导细胞焦亡的潜在机制。这些发现将G9a定位为一个有前景的治疗靶点，并为TNBC提供了新的治疗视角。
2. 结果
2.1. 敲低G9a及其抑制剂抑制细胞增殖
通过TCGA数据库分析及蛋白质印迹(Western Blot)验证，发现G9a在TNBC组织和细胞系(MDA-MB-231和SUM159PT)中的表达显著高于正常乳腺组织及细胞系(MCF-10A)。使用小干扰RNA(siRNA)敲低G9a，其中siG9a #1效率最高，用于后续实验。CCK-8实验表明，G9a抑制剂BIX-01294 (BIX)能以时间和剂量依赖性的方式抑制TNBC细胞增殖。EdU染色实验也证实，G9a敲低和BIX处理均能显著降低细胞增殖比例。值得注意的是，G9a敲低可同时抑制G9a表达和H3K9me2甲基化水平，而BIX主要抑制H3K9me2甲基化，对G9a蛋白表达水平无显著影响。
2.2. 敲低和抑制G9a促进细胞凋亡
流式细胞术分析显示，敲低G9a或使用BIX抑制其活性，均能增加TNBC细胞的凋亡率。Western Blot检测凋亡相关蛋白表达，发现促凋亡蛋白BAX表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达变化不显著，表明抑制G9a功能可诱导TNBC细胞发生凋亡。
2.3. 敲低和抑制G9a增强对TNBC细胞侵袭和迁移的抑制
Transwell侵袭实验和伤口愈合划痕实验结果表明，敲低G9a或使用BIX处理，能显著减少TNBC细胞的侵袭细胞数量，并降低伤口愈合率，说明G9a敲低和抑制可减弱TNBC细胞的侵袭和迁移能力。
2.4. G9a影响TNBC细胞MDA-MB-231和SUM159PT的细胞焦亡
透射电子显微镜(TEM)观察发现，敲低G9a的细胞表现出细胞膜起泡的典型细胞焦亡形态学特征。乳酸脱氢酶(LDH)释放实验显示，G9a敲低组LDH释放水平升高，而加入细胞焦亡抑制剂Z-VAD-FMK可降低LDH释放，并部分逆转由G9a敲低引起的LDH升高。
通过qRT-PCR和Western Blot评估细胞焦亡关键蛋白(AIM2、Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18)的表达，发现G9a敲低可上调这些蛋白的mRNA和蛋白表达水平。同样，Z-VAD-FMK可逆转G9a敲低对细胞焦亡的促进作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测也证实，G9a敲低后，细胞上清液中IL-1β和IL-18的水平升高，此效应可被Z-VAD-FMK部分抑制。免疫荧光(IF)染色结果进一步验证了AIM2、Cleaved Caspase-3和GSDME-N蛋白在G9a敲低后荧光强度增强。以上结果综合表明，抑制G9a功能可在TNBC细胞中诱导细胞焦亡。
2.5. G9a通过RIG-I/STAT1/GSDME信号通路调节TNBC细胞焦亡
Western Blot结果显示，敲低G9a可上调RIG-I、磷酸化STAT1 (p-STAT1)和GSDME的表达。加入RIG-I抑制剂Cyclo (Phe-Pro) (cFP)可降低这些蛋白的表达。更重要的是，在敲低G9a的细胞中加入cFP，可部分逆转G9a敲低对GSDME的促进作用。
为探究G9a与RIG-I的相互作用，进行了免疫共沉淀(CO-IP)和免疫荧光共定位实验。CO-IP结果显示G9a与RIG-I存在相互作用。IF实验显示，G9a敲低可增强RIG-I的荧光强度，而cFP可减弱此效应，并减少G9a与RIG-I的共定位(黄色斑点)。类似地，CO-IP也证实了RIG-I与STAT1之间存在相互作用。IF实验进一步表明，G9a敲低增强了RIG-I与STAT1的共定位，cFP可部分逆转此效应。ELISA实验显示，G9a敲低会上调IL-1β和IL-18水平，而cFP可有效降低这两种细胞焦亡相关炎症因子的上调。
这些结果共同揭示了G9a可能通过RIG-I/STAT1/GSDME通路调控TNBC细胞的细胞焦亡过程。
3. 讨论与结论
本研究表明，抑制G9a可抑制TNBC细胞(MDA-MB-231和SUM159PT)的增殖、侵袭和迁移能力，并诱导细胞凋亡和细胞焦亡。此外，我们发现RIG-I/STAT1/GSDME通路可能是G9a参与细胞焦亡过程的潜在机制。我们首次在细胞水平上阐明了G9a如何调控TNBC细胞的细胞焦亡，从而揭示了一种新的机制见解。
G9a在多种肿瘤中过表达，其功能抑制有助于缓解癌症的恶性表现。本研究发现G9a在TNBC细胞中高表达，其敲低或抑制可产生多效性抗癌作用。在细胞焦亡方面，G9a敲低可刺激细胞焦亡相关蛋白的表达，并引起细胞膜形态改变。使用细胞焦亡抑制剂Z-VAD-FMK可部分逆转G9a抑制产生的促焦亡效应，证实了G9a功能抑制可诱导TNBC细胞发生细胞焦亡。
RIG-I和STAT1均在先天免疫和癌症发展中发挥作用。本研究发现了G9a、RIG-I和STAT1在TNBC细胞中形成一个相互作用网络。G9a敲低通过激活RIG-I和p-STAT1的表达来促进GSDME介导的细胞焦亡。抑制RIG-I功能可下调p-STAT1和GSDME的表达，并能部分逆转由G9a敲低引起的细胞焦亡相关炎症因子水平升高。这表明RIG-I/STAT1/GSDME通路可能是G9a诱导TNBC细胞焦亡的潜在机制。
这些发现为G9a作为治疗靶点提供了理论依据，对治疗反应不佳的TNBC患者具有重要意义。当然，本研究也存在一些局限性，例如仅在TNBC细胞系中进行体外研究，G9a如何表观遗传学调控RIG-I的具体机制，以及细胞焦亡抑制剂Z-VAD-FMK对凋亡的影响等，仍需未来进一步探索。
总之，本研究表明G9a在TNBC细胞中高表达。抑制G9a可抑制细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡和细胞焦亡。G9a参与细胞焦亡过程的机制可能与RIG-I/STAT1/GSDME通路有关。该研究结果揭示了抑制G9a功能在TNBC细胞中的治疗潜力。
