《Biomolecules》：Impacts of Oxygen Tension on Developmental Competence of Preimplantation Embryos
Shayesteh Mehdinejadiani,
Brad Link,
John P. Kastelic and
Jacob Thundathil
氧张力是植入前胚胎体外发育的一个关键调控因子。在体内，沿着女性生殖道（从输卵管到子宫），胚胎所处的氧环境是低氧的，范围在2%到10%之间，这远低于大气中的约20%氧浓度。为了在体外重现这种生理条件，理解并精确控制培养体系中的氧张力至关重要，因为它深刻影响着胚胎的发育能力、代谢状态、基因表达和表观遗传编程。
1. 引言
辅助生殖技术（ART）已取得长足进步，但其效率仍有待优化。体外胚胎生产（IVEP）是一项基础的生殖生物技术。优化包括氧张力在内的培养系统，对于提高IVEP成功率和获得健康子代至关重要。长期以来，胚胎培养常在大气氧浓度下进行，但越来越多的证据表明，这种非生理性的高氧环境可能损害胚胎的应激适应能力并降低其发育潜能。首个成功将人类胚胎培养至囊胚阶段的报道就使用了5%的低氧环境，这提示人们很早就认识到模拟体内环境的重要性。
2. 女性生殖道中的氧张力
多项研究致力于明确女性生殖道内的氧张力。在体内，从第1天到第3天的早期卵裂阶段，胚胎暴露于约5%到7%的氧张力中。随着胚胎在第3天晚期进入子宫腔，从8细胞阶段发育到桑葚胚并最终形成囊胚，氧张力逐渐下降到植入时的约2%。子宫在整个孕早期都处于持续的缺氧环境中，这种缺氧可能是一种保护发育中胚胎免受氧诱导毒性的生理机制。在人类中，子宫内平均氧张力约为2.5%至2.6%。因此，体内生殖道的氧张力显著低于大气水平，并且因物种、具体器官和卵巢周期阶段而异。了解这些生理参数对于建立有效的体外胚胎培养系统至关重要。
3. 培养系统中的氧张力及其对胚胎发育的影响：从过去到现在
在体外培养系统中精确控制氧张力是可行的。虽然女性生殖道中存在由多种因素引起的氧张力波动，但在培养中，我们可以专注于控制如培养液成分、温度、pH和氧张力等变量。需要强调的是，生理测量值不应自动等同于体外培养系统中的功能最优值，因为体内胚胎处于一个由母体抗氧化防御、代谢缓冲系统等多种机制支持的动态微环境中，而体外培养是一个相对静态和简化的环境。
3.1. 氧张力对体外成熟（IVM）和卵母细胞能力的影响
大多数IVM方案使用约20%的O2，这远超过卵泡内通常3%到13%的生理范围。在牛、猪和小鼠等多个物种中，低氧张力（5% O2）下的IVM能够增强卵母细胞的发育能力，表现为囊胚质量提高和转录组发生有利变化。一种新型的双阶段体外成熟系统，称为获能IVM（CAPA-IVM），通过在预成熟阶段添加C型钠尿肽（CNP）来维持减数分裂停滞，从而同步卵母细胞的胞质和核成熟，改善发育能力并已成功获得活产。在CAPA-IVM中，在预IVM阶段于低氧（5%）下培养卵丘-卵母细胞复合体（COCs）可显著改善代谢效率，尽管线粒体呼吸降低，但COCs表现出更高的ATP含量，表明能量利用更高效，这可能更好地保存了体内卵泡条件。
3.2. 胚胎培养系统中的低氧（Low）和超低氧（Ultra-Low）
早期研究结果不一，但近期证据表明，生理性氧张力能改善实验室参数和临床结局。基于动物研究，在低氧张力（5% O2）下培养胚胎可一致地改善小鼠、牛和水牛等物种的发育结局。暴露于大气氧（20%）的胚胎囊胚孵化率、总细胞数和胚胎质量较低。在人类临床研究中，尽管不同氧张力对受精率、囊胚形成和质量或妊娠结局的影响可能不显著，但许多研究报道，在5% O2下整个培养期培养的胚胎，其囊胚总产量、第3天和第5天胚胎质量均有显著改善，并与显著更高的妊娠率和活产率相关。近年来，许多ART实验室的标准实践已转向使用三气培养箱系统在5% O2下培养胚胎，欧洲人类生殖与胚胎学学会（ESHRE）的指南也推荐此做法。
由于发现子宫中的氧张力甚至低于输卵管，一些研究提倡在2% O2下进行胚胎培养以更好地模拟体内环境。然而，在2%环境下培养胚胎产生了不一致的结果。小鼠胚胎在2% O2下培养会导致囊胚产量、平均细胞数、囊胚腔大小和扩张程度下降。在牦牛中，1% O2张力组凋亡细胞数量显著增加。这表明大气氧和超低氧条件都可能诱导细胞凋亡。
3.3. 培养系统中的双阶段氧策略：提升胚胎能力和临床成功率的新前沿
不同的发育阶段可能需要不同的氧张力。模仿自然的氧梯度（例如从5%降至2%）而非恒定的5%氧张力，可能对胚胎培养更为生理。尽管几项人类研究报告，在双阶段培养系统中（从20%降至5%或从5%降至2%）相比单阶段低氧培养条件，胚胎发育没有显著优势，但氧张力在卵裂期和 compaction 后阶段都能影响胚胎发育。
有研究比较了在三种氧张力（2%、5%和20%）下解冻后人类胚胎的延长培养。在5% O2张力下将解冻胚胎培养至囊胚阶段可获得最佳的发育结局。另一项研究显示，暴露于5%到2% O2梯度的人类受精卵，其胚胎发育和形态学分级相对于5% O2组有显著改善，且没有2% O2组观察到的凋亡增加。来自人类IVF周期的临床证据表明，双阶段氧策略（5%到2%）显著增加了可用囊胚数量和累积活产率。这种双阶段培养方法可能是增加整倍体、具有发育能力的囊胚产量的一个有价值的替代方案。
动物研究为此提供了机制性见解。在牛胚胎中，在5% O2和从20%到5%的序贯条件下培养的囊胚，其总细胞数显著高于2%或20% O2下的囊胚，并且细胞凋亡发生率降低。另一项近期牛胚胎研究发现，在低氧（6%）下，36%的胚胎发育到囊胚阶段，而在大气条件下仅为13%，而暴露于超低氧（2%）的胚胎发育潜力显著降低，仅4.6%形成囊胚。
大多数研究表明，使用5% O2培养胚胎是有益的。然而，迄今为止，关于低氧（5%）和超低氧（1-2%）张力在体外胚胎培养中影响的研究产生了相互矛盾的结果，需要进一步研究。
4. 植入前胚胎的氧摄取和代谢
输卵管和子宫内氧张力的降低被认为是调节胚胎发育能力的关键生理因素。随着胚胎从卵裂期发育到囊胚期，耗氧量增加。在植入前阶段，哺乳动物胚胎主要依赖 Krebs 循环和氧化磷酸化的氧化代谢。然而，随着发育进行到囊胚阶段，对糖酵解的依赖增加。从氧化磷酸化向有氧糖酵解的转变受到严格调控，并可能受到体外培养条件的干扰。
对高质量第3天胚胎代谢谱的分析表明，关键代谢物（如葡萄糖和脂肪酸）的浓度在大气氧和低氧条件下具有可比性。然而，对人类囊胚的近期研究表明，氧张力的变化（例如从5%到2%）可显著影响合成代谢氨基酸和与氧化还原平衡相关代谢物的丰度。
小鼠胚胎在大气氧条件下培养时，葡萄糖和天冬氨酸的摄取减少，而谷氨酸和鸟氨酸的产生增加。在低氧条件下培养的小鼠胚胎，其丙酮酸氧化增加，形成的囊胚细胞数更多，凋亡细胞更少。在大气氧条件下，与糖酵解、糖异生和氨基酸合成相关的基因在牛囊胚中没有上调，这种代谢不足可能解释了发育能力降低的原因。
尽管胚胎对氧变化具有一定的可塑性，但尽量减少环境压力对于避免能量转向应激反应至关重要，否则可能损害生存能力、植入潜力和妊娠结局。在培养的胚胎中，氧化应激常与细胞质碎片化相关，这是胚胎质量受损的标志。重要的是，即使没有明显的形态异常，氧化损伤也可能损害人类胚胎的发育能力。体外培养，尤其是在氧张力升高的情况下，可能会损害线粒体的结构和功能，并对胚胎发育产生不利影响。
5. 氧张力对植入前胚胎基因表达的影响
5.1. 氧张力调节植入前胚胎的全基因组差异基因表达
氧张力对来自IVF/ICSI的胚胎基因表达的影响是可变的。在低氧条件（5%）下培养导致117个基因上调，这些基因参与细胞形态发生和肌肉收缩等生物过程。相比之下，在高氧（20%）下培养的胚胎有66个基因上调，主要与感觉知觉和刺激反应相关。
在牛胚胎中，大气氧张力延迟了胚胎基因组激活（EGA）期间母体转录本的降解，这是重编程胚胎细胞谱系所必需的过程。转录组分析显示两种条件之间的基因表达谱存在显著差异。在低氧下上调的基因主要与分子结合、翻译活性、RNA生物合成和RNA代谢相关。在超低氧条件（序贯培养6%到2%）下发育的牛囊胚，与16细胞阶段相比下调基因的数量多于在低氧（单阶段6%）条件下培养的囊胚。与大气氧条件下培养的囊胚相比，暴露于超低氧的囊胚表现出糖酵解、氨基酸合成和脂肪酸生物合成相关基因的上调。
一项对人类囊胚的转录组分析发现，双阶段氧策略（5%到2%）调节了与胚胎发育和植入能力相关的关键通路，包括细胞组装和组织、DNA复制、重组和修复、细胞周期调控等。然而，另一项研究观察到，在恒定5% O2环境与序贯5%到2% O2下培养的人类囊胚，其转录谱没有显著差异。
5.2. 氧张力调节参与氧化应激和胚胎代谢调控的基因表达
氧化稳态是影响体外生产胚胎质量的一个关键因素。在体外培养中，胚胎缺乏女性生殖道中存在的酶和非酶抗氧化剂。因此，在大气氧张力下培养胚胎会导致过量的活性氧（ROS），在缺乏足够抗氧化防御的情况下引发氧化应激。
NFE2L2（NRF2）信号通路是细胞氧化应激反应的核心参与者。在20% O2下培养的胚胎NRF2表达升高，而在5% O2下维持的胚胎KEAP1表达更高。在20% O2下培养的胚胎，经典抗氧化基因如SOD1、SOD2、PRDX1等的表达升高。小鼠胚胎在2% O2下培养与体内来源的囊胚相比，NRF2表达上调，这似乎反映了暴露于非生理性缺氧环境所触发的应激反应机制。
热休克蛋白HSP70的mRNA表达在体外来源的胚胎中高于体内发育的胚胎。小鼠胚胎在2% O2下培养显著提高了HSP70的表达。人类胚胎在2% O2下培养也观察到HSP70表达升高。此外，HSP70表达在20% O2下培养的人类胚胎中也增加。
在氧化应激诱导下，小鼠囊胚中关键的抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著升高。在牦牛模型中，在5% O2下培养的COCs和囊胚，抗凋亡标志物Bcl-2表达升高，同时促凋亡因子BAX减少。同样，在20% O2下培养的人类胚胎，其应激和凋亡相关基因（包括BAX、G6PD、MnSOD和HSP70）的表达水平显著高于在降低氧条件（2%或5% O2）下培养的胚胎。
低氧条件（5% O2）下，与葡萄糖摄取和糖酵解相关的基因GLUT1、GAPDH和LDHA在COCs中上调，而G6PD表达在5% O2下降低。这些变化表明代谢向增强的葡萄糖摄取和无氧糖酵解转移。氧张力也影响与卵母细胞发育能力相关的基因。在5% O2下，调节减数分裂进程的关键调控因子CCNB1以及GATM和LUM的多聚腺苷酸化mRNA含量显著降低。相比之下，GREM1的多聚腺苷酸化mRNA和蛋白水平在5% O2下升高。关于氧化还原调控，抗氧化酶GPX1在5% O2下的表达水平低于其他组，而MnSOD表达保持不变。
胚胎发育标志物CDX2、POU5F1、SOX2和NANOG的转录水平在5% O2张力下成熟的IVF来源囊胚中升高。此外，2% O2张力调节了 compaction 后小鼠胚胎中GLUT-1、GLUT-3和VEGF的表达。几项研究表明，在低氧条件下培养胚胎能显著上调GLUT-3表达。这种GLUT-3表达的增加增强了葡萄糖摄取，促进了足够的ATP生产，同时最大限度地减少了ROS并增加了线粒体膜电位，从而促进胚胎发育。
6. 氧张力对早期胚胎和胚外组织表观遗传编程的影响
6.1. 植入前发育过程中受氧张力影响的表观遗传调控因子
关于不同氧张力对调控机制，特别是表观遗传修饰的影响，现有信息有限。在植入前发育过程中，有效的表观遗传调控对于实现适当的基因表达模式以使胚胎生长和存活至关重要。此外，表观遗传机制似乎对培养条件的变化特别敏感。
在暴露于20% O2张力的牛植入前胚胎中观察到全球DNA甲基化增加，表明氧化应激可能影响胚胎表观基因组的改变。大气氧张力显著影响了组蛋白修饰H3K9me2和H3K4me2，在20% O2张力下培养的胚胎表现出这两种抑制性和允许性标记水平均增加。
氧张力在调控染色质重塑关键酶的转录中发挥作用。在小鼠胚胎干细胞中，氧张力影响了TET酶家族和 de novo DNA 甲基转移酶Dnmt3a的表达。这些转录变化与几个印迹基因（包括H19、Igf2、Igf2r和Peg3）的调控改变有关。类似地，体外产生并暴露于大气氧张力的牛胚胎，其TET1、TET3、DNMT3a和甲基化辅因子HELLS的表达被打乱。大气氧暴露也影响了Polycomb抑制复合物成分、组蛋白甲基转移酶SETDB1以及几种组蛋白去甲基化酶的转录水平。这些分子改变伴随着胚胎生存力降低和多能性标记NANOG和SOX2的表达减少。
乳酸化是一种主要与组蛋白相关的新型表观遗传修饰。在囊胚阶段，乳酸浓度达到峰值，而组蛋白乳酸化直接受乳酸影响。氧张力通过调节LDHA表达和活性间接影响这一过程：在梯度氧张力（5%到2%）下，胚胎LDHA表达降低，糖酵解通量减少，导致乳酸产生减少，进而降低了组蛋白乳酸化标记（如H3K18la和H3K23la）。这些表观遗传变化可能破坏早期发育所必需的基因表达程序。
6.2. 对胎盘和出生后健康的长期表观遗传改变
植入前发育期间的表观遗传重编程对配子和早期胚胎周围的环境高度敏感。体外胚胎培养期间的氧张力已成为表观遗传稳定性的关键决定因素。来自人类和动物研究的证据表明，氧张力的变化可以影响胚胎和胎盘组织中的DNA甲基化模式，可能影响胎儿发育和出生后结局。
一项小鼠研究发现，与自然受孕相比，在两种氧张力（5%和20%）下进行IVF会增加胎盘中印迹基因随机表观遗传改变的频率。在20% O2下培养的胚胎来源的胎盘，在Peg3印迹控制区（ICR）的甲基化发生显著改变。然而，在H19/Igf2 ICR，无论培养期间的氧张力如何，两个IVF组都观察到异常的甲基化。
一项对人类胎盘组织的研究评估了自然受孕与通过IVF受孕的胎盘中重复元件（特别是LINE1序列）的全球DNA甲基化。在20%大气氧条件下培养的胚胎来源的胎盘，其LINE1甲基化相对于自然受孕有显著改变。相比之下，在低氧张力（5% O2）下培养的胚胎来源的胎盘表现出更接近于体内受孕的甲基化模式。这表明在早期胚胎发育期间暴露于大气氧张力可能对后代产生持续的表观遗传效应。
虽然关于胚胎培养期间不同氧张力对出生后影响的人类临床数据仍然有限，但现有研究通常报告在单胎和双胎分娩率、早产率、出生体重、孕龄或先天异常等直接新生儿结局方面没有显著差异。然而，一项大型回顾性人类队列研究显示，在5% O2下培养的胚胎与20% O2下培养的相比，胚胎质量和累积活产率有所改善，并且在20% O2组中报告了出生体重的适度增加。动物模型，特别是小鼠的证据表明，暴露于非生理性氧张力（特别是2%等超低氧）的胚胎会出现发育紊乱，包括胎儿吸收率增加和胎儿体重减轻。
7. 未来展望
未来研究应侧重于阐明氧张力调控关键表观遗传修饰因子（如DNA甲基转移酶、组蛋白修饰酶和非编码RNA）的分子机制。特别应着重理解这些表观遗传改变的时间和可逆性以及对后代健康的长期影响。重要的是，动态波动比静态氧张力更能准确地模拟体内条件。研究氧变异性如何影响基因调控网络可以提供对胚胎发育的关键见解。为了实现这些目标，开发能够实时监测和调节氧张力的先进胚胎培养系统至关重要。
未来的研究还应确定在体外复制测量的体内氧水平是否真正是最优的。在缺乏母体缓冲系统和生理梯度的情况下，培养中功能上最优的氧浓度可能与体内值不同。建立这种体外特异性最优值需要对发育能力、基因组完整性、表观遗传稳定性以及长期安全性在静态和动态氧策略中进行系统评估。
同时，应进一步研究氧张力与培养液成分之间的相互作用。蛋白质组学和代谢组学分析可以确定特定成分（包括氨基酸、生长因子和代谢底物）如何响应不同的氧条件并影响胚胎结局。抗氧化剂的作用也需要仔细优化，因为其功效可能取决于特定的氧环境。最后，将人工智能整合到ART中具有重要前景。AI系统可以合成复杂的数据集，包括氧动力学、代谢谱、基因表达和形态特征，以创建个性化的、适应性的培养方案，从而可能通过个性化胚胎护理提高植入率和临床结局。
8. 结论
本综述探讨了氧张力对体外胚胎发育的影响，重点关注胚胎的发育能力、代谢、基因表达和表观遗传改变。累积的证据表明，低氧张力（更接近生理状态）能更好地支持胚胎的生存力、质量和发育能力。氧张力不仅影响细胞代谢，还影响基因调控和表观遗传编程，这两者对于胚胎能力和长期健康结局都至关重要。
在大气氧（~20%）下培养与氧化应激增加有关，导致异常的DNA甲基化、基因网络紊乱和发育受损。相比之下，较低的氧（5%至6%）更符合体内条件，并得到多项临床研究和随机试验的支持，证明与大气氧相比能改善胚胎培养结局。尽管氧需求因物种而异，但大多数比较5%与20% O2的人类研究报告未显示大气条件的优势。总的来说，目前可用的基于结局的人类证据广泛支持使用约5% O2作为首选的临床培养条件。
支持超低氧（例如2%）的证据仍然有限，因为它主要来源于实验性、动物或分子水平的研究，而非有足够统计效力的临床结局研究。同样，双阶段氧策略（前3天5%，随后2%）代表了一种生物学上合理且可能有益的方法；然而，目前应将其视为假设生成性的，需要在精心设计的前瞻性人类临床试验中进行验证，然后才能常规临床实施。
尽管胚胎对氧变化表现出一定程度的可塑性，但尽量减少环境压力对于避免能量转向应激反应至关重要，否则可能损害生存能力、植入潜力和妊娠结局。较低的氧张力促进了囊胚形成的改善，并支持选择性单胚胎移植。然而，未来的研究应优先将分子和表观遗传学发现与临床相关的生殖结局相关联，包括囊胚、胎儿组织和胎盘中基因表达和DNA甲基化，特别是印迹和非印迹基因。由于氧张力不仅影响早期胚胎发育，还可能影响长期和跨代健康结局，因此更全面地理解这些潜在机制对于完善体外培养条件和提高ART的安全性和有效性至关重要。
