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本研究通过整合孤独症谱系障碍（ASD）患者与CNTNAP2基因敲除小鼠的脑组织及血清蛋白质组数据，识别出132个在物种间一致失调的蛋白质，并利用机器学习筛选出10个关键蛋白（COL1A1, ITIH4, CLU, NID1, C5, MASP1, PON1, PLTP, HSPA5, FETUB）构成诊断标志物组合，经XGBClassifier验证在独立测试集中展现出良好的诊断性能（AUC = 0.75）。该工作为ASD的生物标志物发现提供了一种基于多物种、多组学数据整合与人工智能分析的新策略。
引言
孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种具有高度异质性的神经发育障碍，目前诊断主要依赖行为评估，缺乏客观的生物标志物。本研究旨在通过跨物种蛋白质组学整合方法，结合机器学习分析，挖掘与ASD相关的保守分子特征，为开发可靠的诊断工具提供新思路。研究以CNTNAP2基因敲除（Knockout, KO）小鼠——一种成熟的ASD遗传模型——以及人类ASD患者的血清样本为主要研究对象。
方法
研究首先对CNTNAP2 KO小鼠的脑组织和血清，以及人类ASD患者和神经典型对照者的血清进行了定量蛋白质组学分析。样本处理包括高丰度蛋白去除、酶解和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。使用DIA-NN等软件进行蛋白质鉴定和定量，并通过统计方法筛选差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs）。
为进行跨物种比较，研究人员将小鼠蛋白质数据通过g:Profiler平台和UniProt数据库映射到其人类同源物，仅保留明确的一对一同源关系。最终，整合了来自小鼠脑、小鼠血清和人类血清三个数据集中共同检测到的蛋白质，构成了一个“物种间共享同源蛋白集”。这个集合的定义基于蛋白质身份和跨物种可检测性，而非表达水平变化的一致性。
在机器学习和生物标志物筛选方面，研究者从共享蛋白集及通过蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析识别的蛋白质中提取特征。使用Extra Trees Classifier进行特征重要性排序，筛选出最具区分力的蛋白质组合。随后，评估了包括XGBClassifier在内的多种机器学习算法在训练集和独立测试集上的性能，通过准确度、敏感度、特异度和受试者工作特征曲线下面积（Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve, AUROC）等指标进行模型评估。
结果
3.1. CNTNAP2 KO小鼠与人类ASD患者的蛋白质组分析
蛋白质组学分析显示，在小鼠血清中鉴定出1706个蛋白质，其中589个为DEPs。在小鼠脑组织中鉴定出8915个蛋白质，其中495个为DEPs。在人类ASD血清中鉴定出242个蛋白质，其中132个为DEPs。这些差异表达情况通过火山图进行了可视化展示。
3.2. 跨物种比较分析
通过同源映射和数据集整合，研究发现有1018个蛋白质在小鼠脑和血清中均有检测。更重要的是，有132个蛋白质在小鼠脑、小鼠血清和人类ASD血清三个数据集中被共同检测到，构成了一个共享的同源蛋白核心集。该工作流程和蛋白质重叠情况通过维恩图进行了总结。对共享蛋白集分别进行小鼠和人类数据的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，揭示了涉及补体和凝血级联、血浆脂蛋白颗粒代谢、氧化应激等相关过程的蛋白质功能簇。
3.3. 利用机器学习识别生物标志物组合
通过基于Extra Trees Classifier的特征选择，研究确定了10个排名最高的蛋白质：COL1A1, ITIH4, CLU, NID1, C5, MASP1, PON1, PLTP, HSPA5, FETUB。这些蛋白质的特征重要性排序如图所示。在评估的多种机器学习算法中，XGBClassifier在独立测试集上表现最佳，其准确度为0.78，敏感度为0.67，特异度为0.82，AUROC为0.82。该模型的性能通过ROC曲线（AUC=0.75）、精确率-召回率曲线和混淆矩阵进行了评估。
3.4. 生物标志物在ASD患者血清中的差异表达
进一步分析显示，在ASD患者与对照者的血清中，除补体成分C5外，其余9个候选蛋白质均表现出显著的差异表达，这增强了该生物标志物组合用于ASD诊断的潜力。
3.5. 通路与网络分析
对10个候选生物标志物进行功能富集分析（Gene Ontology, GO; KEGG）显示，它们在突触信号传导、免疫相关过程、细胞应激反应和代谢调节等方面显著富集。其功能富集情况通过气泡图进行了展示。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步将这些蛋白质划分为不同的功能簇，包括一个与脂质代谢相关的簇、一个包含COL1A1和NID1的细胞外基质相关簇，以及一个以MASP1为中心的免疫相关节点。其中，CLU在网络中显示出最高的连接度，可能作为连接不同功能模块的枢纽。
讨论
本研究通过整合CNTNAP2 KO小鼠和人类ASD患者的蛋白质组数据，识别出一个由132个蛋白质组成的跨物种共享同源蛋白集，这些蛋白质反映了基于蛋白质身份和跨物种存在性的共享分子特征，而非表达变化方向的一致性。这为超越单一物种或组织分析、优先筛选与ASD生物学相关的候选分子特征提供了框架。
利用机器学习从该共享蛋白集中筛选出的10个蛋白质组合，在本研究分析的队列中显示出区分ASD与对照样本的能力。然而，该结果基于内部交叉验证和单一训练/测试集划分，且队列未按临床亚型、症状严重程度等进行分层，因此应被视为探索性和假设生成性的，而非具有广泛诊断适用性的通用标签。
功能分析表明，这些候选蛋白质涉及突触信号、免疫调节、氧化应激反应和代谢通路等多个生物学过程，与ASD的已知病理生理机制相吻合。特别是脂质代谢和氧化应激相关蛋白的富集，提示了代谢失衡在ASD中的潜在作用。蛋白质CLU作为网络枢纽，可能在连接代谢和免疫通路中扮演整合角色。同时，补体系统成分（如C5）和ITIH家族蛋白的参与，进一步支持了神经免疫失调机制在ASD中的相关性。
结论
与以往主要关注遗传变异、免疫标志物或氧化应激的ASD生物标志物研究相比，本研究提供了一个互补的视角，强调在蛋白质组水平上识别跨物种共享的同源蛋白质特征。通过将跨物种蛋白质组学与机器学习和网络分析相结合，该研究优先筛选了可能与ASD相关生物学过程有关的候选分子特征，有助于将动物模型的分子观察结果与人类ASD样本中的发现联系起来。
研究也存在一些局限性，包括队列规模有限、依赖单一的ASD小鼠模型、机器学习分析缺乏独立的外部验证等。未来的研究需要在更大规模、表型分层的患者队列以及更多ASD相关动物模型中进行验证，并整合多组学方法，以评估所发现生物标志物的普遍性、稳健性和潜在的临床应用价值。总之，本研究证明了跨物种蛋白质组学整合结合机器学习与网络分析，可作为识别ASD相关候选分子特征的有效发现框架。
