《Biomolecules》：Therapeutic Potential of Deferiprone–Resveratrol Hybrid (DFP-RVT) Against Hepatic Iron Overload in β-Thalassemia Mice: A Proteomic Analysis
Supawadee Maneekesorn,
Yodying Yingchutrakul,
Nattapon Simanon,
Jakkaphan Kumsab,
Chutikarn Butkinaree,
Sutpirat Moonmuang,
Jin Li,
Pimlak Charoenkwan,
Pimpisid Koonyosying and
Hataichanok Chuljerm
+ 2 authors
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本研究通过蛋白质组学分析，揭示了肝脏铁过载导致β-地中海贫血小鼠线粒体蛋白（如frataxin）显著下调，而新型铁螯合剂-抗氧化杂合物DFP-RVT可恢复其表达，改善线粒体功能和能量代谢。该工作为DFP-RVT通过调控铁-硫簇生物发生来修复铁诱导的线粒体功能障碍提供了新机制见解。
引言
β-地中海贫血是一种因β-珠蛋白基因缺陷导致的遗传性贫血性疾病，主要并发症之一是铁过载。在输血依赖型患者中，铁过载主要源于反复输血；在非输血依赖型患者中，则主要由无效红细胞生成驱动的肠道铁吸收增加所致。过量铁在肝脏等器官沉积，通过芬顿反应产生活性氧，引发氧化应激、线粒体功能障碍，最终导致肝损伤、纤维化甚至肝癌。地佛斯卓-白藜芦醇杂合物（Deferiprone–Resveratrol hybrid, DFP-RVT）是一种将铁螯合剂地佛斯卓（DFP）的螯合基团与抗氧化剂白藜芦醇的骨架结合而成的新型化合物，旨在同时发挥铁螯合与抗氧化作用。先前研究已证实DFP-RVT在减轻铁负荷、改善贫血和肝损伤方面的效果，但其分子机制尚不完全清楚。本研究首次运用肝脏蛋白质组学方法，在铁过载β-地中海贫血小鼠模型中，系统探究了DFP-RVT治疗的分子效应。
材料与方法
研究使用雄性杂合子β-珠蛋白敲除（BKO, Hbbth3/+）小鼠。通过连续20天腹腔注射右旋糖酐铁（10 mg/天）诱导肝铁过载模型。铁过载小鼠随后被随机分为两组，分别口服去离子水或DFP-RVT（122 mg/kg/天）治疗60天，并设非铁过载对照组。治疗结束后，采集肝脏组织进行蛋白质组学分析。蛋白质提取、胰蛋白酶消化后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定和定量。差异表达蛋白通过生物信息学工具进行功能注释和通路分析。
结果
3.1. 蛋白质组学分析
3.1.1. 铁过载β-地中海贫血小鼠（IO）的蛋白质组学分析
与未铁过载的BKO对照组相比，铁过载（IO）组肝脏中共鉴定出334个差异表达蛋白，其中199个上调，135个下调。基因本体（GO）分析显示，差异蛋白主要富集于代谢过程、蛋白质结合和细胞内解剖结构等类别。功能分析表明，上调蛋白与胰腺分泌、炎症、肝纤维化和细胞死亡等器官功能障碍相关。而下调的蛋白中，约25%（35个）是线粒体组分，特别是参与氧化磷酸化、ATP合成和线粒体蛋白转运的关键蛋白，包括frataxin。此外，凝血因子X也显著下调。这些变化提示铁过载与炎症损伤增强、线粒体能量代谢和凝血通路抑制相关。
3.1.2. DFP-RVT治疗铁过载小鼠（DR-IO）的蛋白质组学分析
对比未治疗的IO组，DFP-RVT治疗组（DR-IO）共鉴定出396个差异表达蛋白，其中223个上调，173个下调。GO分类与IO组相似。在223个上调蛋白中，包含43个线粒体组分蛋白和15个翻译通路蛋白。值得注意的是，在IO组中下调的、参与氧化磷酸化和ATP合成的多个线粒体蛋白，在治疗后得到恢复。相反，173个下调蛋白则与胰腺分泌、炎症、细胞死亡和肝纤维化相关，表明DFP-RVT治疗缓解了铁诱导的病理反应。
3.2. 上、下调蛋白的特征分析
韦恩图分析揭示了不同比较组之间共享和特有的蛋白。特别重要的是，有45个在IO/BKO中上调的蛋白，在DR-IO/IO中转为下调，这些蛋白涉及胰腺分泌（如胰蛋白酶-4、胰凝乳蛋白酶原B）、炎症（如甲酰肽受体2、H-2 II类组织相容性抗原）以及细胞死亡和纤维化过程（如TAR DNA结合蛋白43）。这表明DFP-RVT治疗减轻了炎症，保护了肝组织结构，改善了细胞膜损伤，并阻止了纤维化发展。另一方面，有92个在IO/BKO中下调的蛋白在DR-IO/IO中转为上调，其中24%（22个）是线粒体组分。这包括氧化磷酸化和ATP合成中的关键酶，如Frataxin、NADH脱氢酶1 β亚基复合体5、细胞色素c氧化酶亚基6A1，以及线粒体转运蛋白如线粒体输入内膜转位酶亚基TIM50。此前在IO组下调的凝血因子X也在治疗后恢复。这些发现共同表明，DFP-RVT改善了细胞器损伤，特别是对能量生产、血红素合成和铁-硫簇组装至关重要的线粒体。
3.3. DFP-RVT通过调控铁-硫簇生物发生恢复线粒体功能
蛋白质组学分析显示，IO小鼠中线粒体蛋白普遍下调，而DFP-RVT治疗后则显著上调了多种线粒体蛋白。这些改变的蛋白包括氧化磷酸化系统的组分，特别是复合物I（NADH脱氢酶1亚复合体亚基5, 7, 8）和复合物IV（细胞色素c氧化酶亚基6A1）的亚基，它们是线粒体电子传递和ATP合成的核心。此外，在线粒体铁代谢和铁-硫簇（ISC）合成中起关键作用的frataxin，在IO组中显著下调，而在治疗后得以恢复。Frataxin表达减少会破坏线粒体铁稳态并损害呼吸链功能。综合来看，DFP-RVT通过恢复参与氧化磷酸化和铁-硫簇代谢的蛋白表达，缓解了铁诱导的线粒体功能障碍。Frataxin和线粒体呼吸组分的恢复，支持了DFP-RVT在铁过载条件下对维持线粒体完整性和改善肝脏能量代谢的保护作用。
讨论
在β-地中海贫血中，过量铁积累催化芬顿反应产生活性氧，导致氧化应激，引发脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA损伤，并最终导致肝细胞死亡和组织损伤。同时，脂质过氧化产物激活TGF-β1，刺激胶原沉积和纤维化。铁螯合是减少不稳定铁、减轻ROS介导毒性的核心治疗策略。DFP-RVT因其铁螯合和抗氧化双重特性，能有效螯合氧化还原活性铁，并具有自由基清除活性。
本研究的蛋白质组学发现，铁过载导致线粒体蛋白显著下调，并伴随胰腺分泌、炎症、肝纤维化和细胞死亡相关蛋白的上调。这与之前研究指出地中海贫血中线粒体功能障碍源于红细胞能量需求增加、铁过载氧化应激的观点一致。相反，DFP-RVT治疗恢复了线粒体蛋白表达，并增加了翻译和线粒体维持相关蛋白的丰度，提示线粒体完整性和代谢能力的恢复。线粒体是细胞能量生产、氧化还原平衡、凋亡和铁代谢（包括血红素合成和Fe-S簇组装）的核心调节器。在本研究中，frataxin成为一个关键的调控节点。Frataxin对于线粒体铁稳态至关重要，在线粒体铁分布、Fe-S簇组装和呼吸链功能中发挥核心作用。其在IO小鼠中的减少可能由铁毒性驱动，并导致肝细胞损伤。DFP-RVT治疗恢复了frataxin表达，这可能是线粒体蛋白水平和整体功能恢复的原因。有趣的是，本研究未发现铁稳态蛋白（如hepcidin、ferritin）和经典抗氧化酶（如GPx、SOD）在蛋白质组水平发生显著变化，这表明该模型中铁诱导的氧化损伤主要由线粒体功能障碍和铁分布异常驱动，而非经典抗氧化系统的表达改变。
本研究的局限性在于未设置地佛斯卓（DFP）单独治疗组，因此无法直接比较标准螯合剂DFP与新型杂合物DFP-RVT的作用机制差异。未来的研究需要纳入DFP对照组，以优化治疗策略。
结论
本研究证明，β-地中海贫血中的肝铁过载与线粒体功能障碍、代谢紊乱以及炎症、纤维化和细胞损伤通路的激活相关。蛋白质组学分析表明，DFP-RVT治疗部分改善了铁诱导的肝损伤，主要通过恢复线粒体相关蛋白表达和改善线粒体完整性来实现。值得注意的是，DFP-RVT恢复了包括frataxin在内的关键线粒体蛋白的表达，提示其在逆转铁诱导的线粒体损伤中具有潜在作用。这些发现为DFP-RVT如何在铁过载条件下发挥肝保护作用提供了机制性见解，并支持其作为一种靶向线粒体的治疗策略，用于治疗β-地中海贫血相关的铁过载性肝病的潜力。
