细胞外基质通过YAP-PIEZO1信号轴调控融合阴性横纹肌肉瘤的侵袭 中文标题：揭示肿瘤侵袭新机制：细胞外基质密度如何通过YAP-PIEZO1轴驱动融合阴性横纹肌肉瘤的恶化

《Cancers》：The Extracellular Matrix Regulates Invasion in Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma via YAP–PIEZO1 Signaling Axis Yuanzhong Pan, Juha Kim, Brian M. Wong, Esteban Cobo Espuny and JinSeok Park

本研究首次阐明，细胞外基质(ECM)的高密度会通过激活机械信号传导蛋白YAP，进而直接上调机械敏感性离子通道PIEZO1的表达，导致钙离子(Ca2+)内流，最终促进融合阴性横纹肌肉瘤(FNRMS)的侵袭。这项发现为这种临床预后较差的儿童软组织肉瘤提供了新的治疗靶点。

　　

融合阴性横纹肌肉瘤细胞的侵袭行为在高细胞外基质密度下增强

横纹肌肉瘤(RMS)是儿童和青少年中最常见的软组织肉瘤，融合阴性横纹肌肉瘤(FNRMS)是其最常见的亚型，约占病例的60%。其侵袭行为是导致复发和不良预后的主要原因，但潜在机制尚不清楚。肿瘤的进展不仅受细胞内在致癌程序的调控，也受到肿瘤微环境(TME)生物物理和生化特性的影响。其中，细胞外基质(ECM)在调节癌细胞迁移、侵袭和存活中起着关键作用。

为了探究ECM密度如何影响FNRMS细胞的迁移行为，研究人员使用三维(3D)球体侵袭实验，将FNRMS细胞系(RD和SMS-CTR)嵌入不同浓度（0.5%和1.0%）的I型胶原基质中。活细胞成像结果显示，与低密度条件相比，培养在高密度胶原凝胶上的两种细胞系球体都表现出更大的径向扩展，表明其向周围基质的侵袭增强。这种增强的生长在不同初始大小的球体中是一致的，表明该效应独立于初始球体大小。此外，在接种后6小时量化细胞增殖，并未观察到显著差异，证实观察到的表型是侵袭而非增殖所致。相比之下，对ECM信号依赖性较弱的融合阳性横纹肌肉瘤(FPRMS)细胞系RH41进行相同实验，其球体在不同浓度下的生长没有差异。这些结果共同表明，增加的胶原基质密度在三维环境下增强了FNRMS细胞的侵袭潜能。

YAP介导FNRMS细胞的基质依赖性侵袭

癌细胞侵袭受机械信号传导通路的调控，该通路使细胞能够感知并响应ECM的物理特性。转录共激活因子Yes相关蛋白(YAP)是机械信号传导的核心效应因子，已在多种癌症中介导ECM密度依赖性侵袭。本研究探讨了YAP是否介导了在高密度胶原基质上观察到的FNRMS细胞侵袭行为增强。

通过免疫荧光染色检测培养在低或高密度胶原凝胶上的FNRMS球体中YAP的活性。YAP的活性由其亚细胞定位调节：激活后，YAP易位到细胞核，作为转录共激活因子发挥作用。定量分析显示，与低密度条件相比，在高密度胶原基质上培养的RD和SMS-CTR球体中，位于侵袭前沿的细胞核内YAP积累显著增加。这表明增加的基质密度提高了侵袭性FNRMS细胞中的YAP活性。

为确定YAP激活是否足以促进侵袭，研究人员构建了YAP过表达(YAP-OE)的FNRMS细胞并进行球体侵袭实验。定量分析表明，与对照球体相比，YAP过表达显著增加了侵袭性扩展，并且排除了增殖的贡献。这种效应模拟了在高密度胶原基质上观察到的侵袭增强，支持了YAP在驱动ECM依赖性侵袭中的功能作用。这些结果共同证明，YAP活性响应基质密度增加而升高，并且YAP足以促进FNRMS球体的侵袭行为，从而确定YAP是FNRMS中ECM依赖性侵袭的关键介质。

PIEZO1作为FNRMS细胞中YAP信号的下游效应因子

由于YAP主要作为转录共激活因子发挥作用，研究接下来旨在确定YAP调控ECM密度依赖性侵袭的下游效应因子，特别关注可能将ECM密度与细胞内信号程序联系起来的、参与机械信号传导的基因。

PIEZO1是一种机械敏感的钙渗透性离子通道，可将细胞外环境的机械线索转化为细胞内钙信号。由于钙信号促进癌细胞侵袭，PIEZO1介导的钙信号传导与癌细胞侵袭有关。为确定PIEZO1是否是YAP-TEAD1（YAP的主要DNA结合伙伴）在FNRMS中的转录靶点，研究人员重新分析了公开的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据集，这些数据来自通过YAP激活转化的小鼠卫星细胞和作为FNRMS稳健模型的人RD细胞。分析显示，在小鼠和人的FNRMS细胞中，YAP-TEAD1显著占据PIEZO1基因的近端启动子区域。这提示YAP直接调控FNRMS中PIEZO1的转录。

与这一基因组观察结果一致，免疫荧光成像数据的定量分析显示，在单细胞水平上，核YAP强度与PIEZO1蛋白表达之间存在强正线性相关性。为了进一步确定YAP活性是否调控PIEZO1表达，研究人员分析了使用多西环素诱导系统表达组成型活性YAP突变体(YAP-ON)的FNRMS细胞的RNA-seq数据。诱导YAP信号导致PIEZO1转录本水平与非诱导对照细胞相比显著上调。值得注意的是，这种上调是可逆的，因为在诱导撤除后(YAP-OFF)，PIEZO1表达恢复至基线水平。

随后，研究在蛋白水平验证了这些发现。蛋白质印迹分析显示，与对照相比，YAP-OE的FNRMS细胞中PIEZO1表达升高。多次独立实验的量化证实，YAP过表达后PIEZO1丰度具有统计学意义的显著增加。这些数据共同确定PIEZO1是FNRMS细胞中YAP介导的转录调控的下游靶点。

最后，对临床FNRMS患者数据集的分析表明，PIEZO1高表达与较差的总生存期显著相关，这凸显了PIEZO1在FNRMS进展中的临床相关性。这些发现表明，ECM-YAP-PIEZO1轴促进了FNRMS肿瘤的侵袭和恶性行为。

PIEZO1依赖性钙信号传导促进高密度基质上FNRMS细胞的侵袭

为确定PIEZO1是否在功能上促进ECM密度依赖性侵袭，研究首先检测了侵袭性FNRMS球体中PIEZO1的表达。对PIEZO1和YAP进行免疫荧光共染色显示，与低密度条件相比，培养在高密度I型胶原基质中的球体细胞内PIEZO1信号强度显著升高，这与该条件下YAP活性增加一致。

由于PIEZO1作为机械敏感的钙渗透性离子通道发挥作用，研究接下来评估了ECM密度是否调节细胞内钙信号。使用Fluo-4 AM染料对培养在低或高密度I型胶原凝胶上的FNRMS球体进行活细胞钙流成像。定量分析表明，在高密度基质上培养的球体中钙内流显著更高，表明增加的基质浓度增强了FNRMS细胞中的钙信号。

为了评估PIEZO1介导的钙信号对球体侵袭的功能贡献，研究人员通过使用Dooku1（PIEZO1拮抗剂）和GsMTx4（机械通道阻滞剂）进行药理抑制。PIEZO1抑制导致与载体处理的对照组相比，球体扩展面积显著减少，并排除了增殖的贡献。这些数据共同表明，增加的ECM密度与PIEZO1表达升高和钙信号增强相关，进而促进FNRMS细胞的侵袭行为。这些发现支持了一个模型，即PIEZO1介导的钙信号作为YAP下游的关键效应因子，驱动ECM密度依赖性侵袭。

YAP信号传导的药理抑制减弱钙内流和球体侵袭

为了评估本研究中确定的机械信号传导通路（特别是YAP-PIEZO1信号轴）的潜在治疗相关性，研究测试了YAP相关信号的药理抑制是否能抑制在高密度胶原基质中培养的FNRMS球体中观察到的钙内流升高和侵袭行为。研究者使用了维替泊芬(Verteporfin)来破坏YAP与TEAD转录因子的相互作用，从而抑制YAP依赖性转录活性。此外，还使用了Y-27632，这是一种Rho相关蛋白激酶(ROCK)的有效抑制剂，它通过调节细胞骨架张力来响应ECM密度，从而减少YAP的核定位。

活细胞成像显示，与载体处理的对照组相比，用维替泊芬或Y-27632处理均显著降低了FNRMS细胞内的钙内流。与这些结果一致，球体侵袭实验的定量分析表明，两种抑制剂都显著减弱了球体随时间的扩展面积，并排除了增殖的贡献。尽管侵袭并未完全消除，但YAP信号轴的药理抑制显著抑制了ECM密度增强的侵袭表型。这些结果共同表明，靶向YAP-PIEZO1-钙轴可以有效降低FNRMS细胞的侵袭能力，突出了其在高ECM密度背景下作为治疗脆弱性的潜力。

综上所述，这项研究证明了ECM密度增强了FNRMS细胞的侵袭行为，并确定了一条将基质密度与肿瘤细胞侵袭联系起来的机械信号传导通路，即ECM-YAP-PIEZO1信号轴。高密度胶原基质促进了球体扩展的增加，表明侵袭潜力升高。从机制上讲，YAP被确定为FNRMS中ECM密度依赖性侵袭的关键介质。增加的基质密度与侵袭细胞中核YAP定位升高相关，YAP过表达足以增强球体侵袭。研究进一步将机械敏感性钙通道PIEZO1确定为FNRMS细胞中YAP信号的下游效应因子。综合基因组、转录组和蛋白水平的验证，确立PIEZO1是一个受YAP调控的基因。PIEZO1高表达与YAP活性增加相关，并与FNRMS患者较差的临床结局显著相关。功能分析表明，高密度基质增加了球体中PIEZO1的表达和钙内流，直接将机械线索与细胞内钙信号联系起来。PIEZO1的药理抑制导致侵袭显著减少。重要的是，YAP相关信号的药理抑制减弱了钙内流和球体侵袭，支持了YAP在协调FNRMS机械信号输出中的核心作用。这项研究揭示了一条以前未被重视的YAP-PIEZO1信号轴，它将ECM力学与FNRMS的侵袭行为联系起来，增进了我们对FNRMS机械生物学的理解，并表明靶向机械信号传导通路可能是限制这种侵袭性儿童癌症侵袭的补充治疗策略。