评估源于蜜蜂的乳酸菌株及其联合菌群以增强蜜蜂健康与营养的益生潜力

《Microorganisms》：Probiotic Assessment of Lactic Acid Bacteria Strains and Consortia for Enhancing Honey Bee Health and Nutrition Gianluca Albanese, Alexandru Ioan Giurgiu, Adriana Cristina Urcan, Claudia Pa?ca, Tudor Nicolas Ternar, Victori?a Bonta, Dalila Di Criscio, Massimo Iorizzo, Antonio De Cristofaro and Daniel Severus Dezmirean

本文通过一系列体外益生性评估实验，考察了五个源于蜜蜂的乳酸菌（LAB）菌株及其两种联合菌群（LAB Mix 1和2），探究其在养蜂业中的应用前景。研究发现，所测菌株具备良好的自聚集、表面疏水特性，无相互拮抗和溶血活性，可产生多种有机酸，部分菌株具有过氧化物酶活性，且在高糖饲喂糖浆中稀释后生长良好。这些结果表明，这些与蜜蜂相关的LAB及其多菌株配方是极具潜力的益生菌候选者，为开发基于微生物组的可持续养蜂策略提供了重要依据。

　　

引言

西方蜜蜂（Apis melliferaL.）作为关键的授粉昆虫，在生态和经济上均具有重要价值。然而，蜜蜂健康下降促使人们寻求基于微生物组的策略以增强蜂群韧性，减少对化学干预的依赖。蜜蜂肠道菌群，特别是乳酸菌（LAB）和双歧杆菌（Bifidobacteriumspp.），被证实具有益生作用，包括降解复杂碳水化合物、代谢外源物质、合成营养物质、调节肠道稳态、增强免疫力及抑制病原体等。本研究旨在评估两种LAB配方的益生潜力：配方1（LAB Mix 1）包含Apilactobacillus kunkeei和 Lactobacillus apis；配方2（LAB Mix 2）包含Lactiplantibacillus plantarum、Fructobacillus fructosus和 A. kunkeei。通过系统比较单一菌株和多菌株配方在模拟养蜂实践的高糖饲养条件下的表现，对其功能性和安全性相关性状进行研究。

材料与方法

本研究使用了五个LAB菌株，包括三个分离自西方蜜蜂肠道微生物群的菌株和两个参考模式菌株。两个LAB联合菌群（LAB Mix 1 和 LAB Mix 2）由等体积的肉汤培养物（最终浓度1.5 × 10⁸CFU/mL）混合制备。

评估的功能与安全性性状包括：细胞表面特性，通过测定自聚集和细胞表面疏水性来评估其潜在粘附与定植能力；相互拮抗作用，评估菌株间是否存在生长抑制；溶血活性，在含5%脱纤维马血的MRS琼脂上测定，以评估菌株安全性；氧化解毒潜力，通过过氧化物酶和过氧化氢酶活性测试评估其清除活性氧能力；抗生素敏感性，采用Kirby-Bauer纸片扩散法评估对12种抗生素的表型耐药性；有机酸谱，通过HPLC对细胞培养上清液（CFS）进行分析，以量化有机酸产量；在高浓度糖溶液中的生存力，在实验室制备的蔗糖糖浆（SS）和商业养蜂糖浆（ApiSyrup, AS）中，于未稀释、1:1稀释和1:2稀释条件下，通过监测光密度（OD₆₀₀）48小时来评估菌株在高渗透压环境下的生长动力学。所有数据分析均使用RStudio进行，数据以平均值±标准差表示，并进行相应的统计学检验。

结果与讨论

3.1. 细胞表面特性

所有测试菌株的自聚集和表面疏水性均呈现时间依赖性增加。在LAB Mix 1中，A. kunkeeiC1表现出最高的自聚集（24小时达57.9%），LAB Mix 1为54.0%，L. apisC2为49.3%。在LAB Mix 2中，Lp. plantarumA1H1B2、A. kunkeeiST56、F. fructosus346和混合菌株的自聚集也随时间的推移而显著增加。疏水性测试表明，A. kunkeeiST56和LAB Mix 2对甲苯和二甲苯具有极高的亲和力（高达99.1%），而其他菌株则表现出中度至较高的疏水性。这些体外特性与细菌的粘附、生物膜形成和在宿主环境（如蜜蜂肠道）中的持久性相关，为益生菌的初步筛选提供了依据。

3.2. 相互拮抗活性

所有测试菌株之间均未观察到相互拮抗活性，表明它们可以共存而不产生竞争性抑制，适合包含在单一益生菌制剂中。

3.3. 有机酸谱

所有测试菌株和混合培养物的细胞培养上清液（CFS）中均检测到乳酸、乙酸和柠檬酸。其中，Lp. plantarumA1H1B2的乳酸产量最高（25.46 g/L），L. apisC2次之。LAB混合物的有机酸产量也处于较高水平。菌株C1的乙酸产量最高，而A. kunkeei和 F. fructosus相关菌株的乳酸和柠檬酸产量相对较低。这些有机酸，特别是乳酸和乙酸，文献报道与抑制病原体（如Paenibacillus larvae）和调节微孢子虫（如Nosema ceranae）感染有关。

3.4. 测试LAB的氧化解毒潜力

在过氧化物酶/过氧化氢酶活性测试中，Lp. plantarumA1H1B2、A. kunkeeiST56、C1和L. apisC2表现出阳性过氧化物酶活性，但所有菌株均无过氧化氢酶活性。这表明这些LAB可通过过氧化物酶介导的途径降解过氧化氢，有助于维持肠道内的氧化还原稳态，增强其在复杂微生物生态系统中的生存能力和功能。

3.5. LAB菌株的溶血活性

所有测试菌株均显示出γ-溶血（无可见溶血区），而阳性对照Staphylococcus aureus显示出明显的β-溶血。这一结果支持了这些菌株具有良好的安全特性，是益生菌筛选的关键标准。

3.6. 对抗生素的敏感性

抗生素敏感性测试显示，菌株的耐药模式具有菌株特异性和异质性。LAB Mix 1所含菌株对四环素类、氨苄青霉素和红霉素表现出敏感性。而LAB Mix 2所含菌株则表现出更广泛的耐药谱，特别是对万古霉素、卡那霉素和萘啶酸。这些耐药性多为LAB固有的、不可转移的耐药表型。然而，在田间应用前，仍需进行基因组筛查，以排除潜在的可移动耐药元件。

3.7. 糖基蜜蜂饲喂糖浆对LAB益生菌递送的适用性

在高浓度糖浆（2:1 SS和未稀释AS）中，所有菌株的生长均受到严重抑制，表现为延长的滞后期和极低的光密度值。当糖浆稀释到1:1和1:2时，所有LAB的生长均得到显著改善，且混合菌株通常比单一菌株表现出更高的光密度值，表明其对高渗透压环境具有更强的耐受性或存在协同作用。

结论

本研究结果表明，所评估的LAB菌株结合了安全性、功能性和技术适用性，使其在养蜂业益生菌初步筛选中具有成为候选者的潜力。这些菌株表现出高自聚集和表面疏水性，特别是A. kunkeei和 F. fructosus。菌株间无相互拮抗，适合复合配方。其有机酸谱具有菌株特异性，Lp. plantarumA1H1B2和LAB混合物能高产乳酸和柠檬酸。部分菌株具有过氧化物酶活性，可能有助于缓解氧化应激。所有菌株均无溶血活性，且抗生素耐药性主要为固有型。糖浆生长试验表明，混合菌株在高渗透压下表现更优，且糖浆适度稀释可显著提高LAB活性。总体而言，这些结果表明，所评估的LAB，尤其是联合使用时，是用于支持蜜蜂健康和韧性的益生菌配方中有前景的候选者。然而，要将这些发现转化为实际的益生菌或生物防治策略，仍需进行针对病原体的直接抑制试验、全面的基因组安全性评估以及基于田间的功效验证。