从宿主-微生物互作新视角揭示：免疫缺陷C. elegans模型中Raoultella planticola通过BEC-1介导的自噬增强抗感染能力并延长寿命

《Microorganisms》：Between the Sponge and the Tap—Bacterial Communities at Overlooked Hospital Hygiene Hotspots Marek Ussowicz, Monika Rosa, Kornelia Gajek, Anita Brzoza, Tomasz Jarmoliński, Anna Panasiuk, El?bieta Wawrzyniak-Dzier?ek and ?ukasz ?aczmański

本研究利用秀丽隐杆线虫(C. elegans)模型，系统探讨了宿主基因缺陷如何重塑肠道菌群，并揭示了特定富集细菌——植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)通过诱导关键自噬基因bec-1介导的细胞自噬，从而增强宿主对病原体铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA14的抵抗力，并延长宿主寿命的分子机制。研究为理解宿主遗传背景、肠道微生物与免疫防御之间的复杂互作网络提供了新见解。

　　

1. 引言

从线虫到哺乳动物，微生物几乎定植于身体的每个表面，尤其是胃肠道，它们影响着营养、组织发育、免疫系统成熟、病原体抵抗乃至潜在行为。肠道内栖息着复杂的细菌群落，在维持宿主健康和调节疾病方面发挥着关键作用。在进化过程中，动物与微生物形成了错综复杂、相互依存的联系，微生物群显著影响着宿主的生理机能和整体适应性。这些微生物群落（菌群）与宿主遗传因素相互作用，共同塑造宿主性状、促进生物多样性并维持生态稳定。微生物在宿主生态系统内的相互作用多种多样：有些物种产生毒素以在竞争中胜出，而另一些则分泌酶以促进互利。反过来，宿主也进化出机制来抑制有害微生物，同时支持有益菌株，从而推动共同进化并形成稳定的互利共生关系。理解这些相互作用需要将微生物组效应分为三类：微生物对宿主、宿主对微生物以及微生物对微生物，每类都具有独特的进化特征。这个框架有助于阐明菌群如何抵御病原体、促进免疫反应并支持宿主的整体适应性。微生物群落结构和/或功能的破坏（菌群失调）将改变宿主的适应性或疾病易感性。研究提供了令人信服的证据，表明微生物组在身体的各项重要功能中，包括代谢、营养、免疫功能、生理和疾病预防，发挥着至关重要的作用。然而，关于宿主遗传因素如何塑造肠道菌群多样性，以及肠道优势细菌如何影响宿主先天免疫和寿命，仍然知之甚少。

宿主通过免疫反应、屏障功能、生理稳态和微生物迁移来调控其微生物组，塑造微生物性状以利于宿主。这种动态关系催生了微生物组作为“被束缚的生态系统”的概念，在这个系统中，共生体在宿主控制的强烈影响下在生态群落中相互作用。虽然微生物组对宿主生理（包括代谢、免疫和行为）的影响已得到充分证实，但关于宿主在操纵微生物组方面的主动作用，我们所知甚少。宿主遗传因素估计约占微生物组β多样性方差的10%，尽管这种差异很大。类似的研究，例如一项分析超过1000份英国双胞胎粪便样本的研究，将Christensenellaceae鉴定为与改善代谢和降低体重指数相关的最具遗传性的分类群。理解宿主影响微生物定植的具体机制对于理解宿主-微生物组相互作用至关重要。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是研究宿主-微生物相互作用的稳健模型，因其具有可重复的肠道微生物群，且与其自然栖息地的细菌有显著重叠。其遗传可操作性和与新一代测序的兼容性，使得能够详细探索细菌对宿主性状（如抗逆性、寿命和发育）的影响。在其整个生命周期中，C. elegans会遇到病原微生物，因此抵抗这些病原体对于维持健康和生活质量至关重要。C. elegans的先天免疫系统在健康寿命中起着关键作用，并受多个进化上保守的信号通路调控，例如ERK MAPK MPK-1通路、线粒体应激反应通路转录因子ATFS-1、TEAD同源物EGL-44通路、细胞死亡蛋白酶CED-3、TFEB同源物HLH-30介导的自噬和溶酶体通路、胰岛素样DAF-2/DAF-16通路、内质网未折叠蛋白反应通路IRE-1/XBP-1以及DAF-7/TGF-β样信号通路。我们选择了mpk-1、atfs-1、egl-44、ced-3和hlh-30的突变体，因为它们代表了免疫调控和细胞稳态中不同的保守模块，使我们能够研究宿主通路如何塑造肠道群落组成和适应性结果。具体来说，ERK MAPK MPK-1部分通过自噬支持病原体防御；ATFS-1将线粒体应激反应与抗菌程序联系起来，并促进PA14的清除；HLH-30调控宿主防御所需的抗菌和溶酶体-自噬基因；CED-3在感染相关应激下控制细胞凋亡和上皮稳态；而ELG-44调节免疫反应相关的转录程序。总之，这个组合允许系统性地测试通路特异性对定植和宿主表型的影响。

在某些情况下，宿主可以利用有益微生物来增强对病原体入侵的防御。这些肠道细菌可以显著延长线虫的寿命。例如，对分枝杆菌(Mycobacterium) sp. Root265的研究发现了包括多糖和阿拉伯半乳聚糖肽聚糖在内的生物活性分子，它们通过daf-16依赖和daf-16不依赖的途径促进长寿，突显了细菌衍生物的治疗潜力。我们的实验室已经鉴定出几个介导感染抵抗的信号通路，包括ERK MAPK自噬通路、YAP-TEAD信号通路和TOR信号通路。这些发现突显了C. elegans中肠道细菌、自噬和免疫信号通路之间错综复杂的关系，为宿主-病原体相互作用提供了见解。对线虫感染抵抗机制的深入研究将增加我们对感染和免疫相关疾病根本原因的理解，为其预防和治疗提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 土壤微生物群制备和线虫暴露

将果园土、天然林土和花园土等比例混合。向混合物中添加各种类型的腐殖质，包括腐烂的水果、植物茎和叶子，然后彻底混合并发酵两周。发酵后，将混合物分为两部分。一部分在超纯水中浸泡一周以提取微生物。收集所得上清液并以2000 rpm离心以去除沉淀，从而除去原生动物和其他小型生物，富集微生物部分。第二部分通过在121°C高压灭菌30分钟进行灭菌，重复此过程以确保消除大多数微生物。然后将非无菌土壤的微生物浸出液添加到灭菌土壤中，彻底混合，并再发酵两周。将同步化的L1期幼虫阶段的C. elegans引入处理过的土壤中。保持土壤湿润并监测3-4天，在此期间线虫在土壤中定植，其肠道被引入的微生物群落定植。每个实验包括三个生物学重复。在给定实验中，三个重复使用同一批次制备的土壤；然而，独立实验使用独立制备的土壤样品进行。

2.2. 野生线虫的回收

将含有线虫的土壤分成小份，用多层滤纸包裹。密封边缘，并将包裹置于贝尔曼漏斗装置中以促进排水。向漏斗中加入无菌M9溶液，使线虫在重力作用下向下迁移并沉降在底部。将线虫收集过夜至密封锥形瓶中。第二天，取出锥形瓶，小心弃去上清液，留下浓缩的线虫供后续使用。

2.3. C. elegans肠道细菌的分离、培养和鉴定

将20只表面灭菌的C. elegans个体转移到含有100 μL无菌M9缓冲液和两个灭菌钢研磨球的1.5 mL无菌微量离心管中。使用自动组织研磨器匀浆线虫，然后在4000 rpm下离心2分钟。收集上清液并进行10倍、100倍、1000倍和10,000倍系列稀释。从每个稀释液中取100 μL涂布在含有脑心浸液(BHI)、溶菌肉汤(LB)、营养琼脂(NA)和葡萄糖蛋白胨琼脂(AA)的无菌9厘米平板上。样品均匀涂布并在两种条件下培养：密封和不密封。将平板倒置于37°C无菌厌氧培养箱中。作为对照，以同样方式涂布未研磨的野生线虫上清液。孵育6-8小时后，检查平板上的单菌落，确保来自研磨液的菌落代表肠道相关细菌。挑取单个菌落，并在37°C摇动下在700 μL相应的液体培养基中培养。通过使用引物16S-27F和16S-1492R扩增16S rRNA基因，然后进行测序来进行细菌鉴定。根据序列分析，合并冗余菌株。然后将独特的分离株培养并保存以供将来使用。

2.4. 16S rRNA测序和微生物群落分析

将回收的线虫转移到无菌1.5 mL微量离心管中，每管加入300-500 μL线虫悬浮液。将管子牢固密封，在液氮中快速冷冻，并提交进行16S rRNA基因测序。测序由中国上海美吉生物医药科技有限公司在Illumina测序平台上使用引物27F和1492R进行全长16S rRNA基因扩增。随后的数据处理和物种注释使用实验室的基于云平台，结合SILVA数据库和R Studio (R 4.3.3)进行分析。

序列数据使用QIIME2(2024.5)处理，包括质量过滤、合并和去噪以推断ASV并进行嵌合体去除。使用SILVA参考数据库进行分类学分类。统计分析包括Kruskal-Wallis检验和α多样性指标（Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数）以比较不同突变株的细菌多样性。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)评估β多样性，揭示了实验组间不同的微生物群落聚类。使用线性判别分析效应大小(LEfSe)鉴定差异丰富的细菌属。同一实验内不同基因型的样品一起处理和测序，并且样品处理顺序在不同基因型间随机化。通过检查按测序运行/文库制备分层的排序模式来评估潜在的批次效应，未发现其主导样品聚类。我们在多样性分析前进行了额外的测序深度标准化。

2.5. 从C. elegans培养肠道细菌

对野生型(C. elegans N2)和突变株(mpk-1、atfs-1、egl-44、ced-3和hlh-30)进行表面灭菌，并分离和培养其肠道细菌。将匀浆后的线虫悬浮液均匀涂布在四种不同的琼脂培养基上：AA、LB、NA或BHI。在37°C培养平板以允许细菌生长。每种培养基都支持大量不同的单菌落发育。选择具有不同形态特征的菌落，分离并纯化。通过PCR扩增后的16S rRNA基因测序鉴定纯化的菌株。使用EzBioCloud的核苷酸比对工具(BLASTn (2.14.1))分析所得序列，并与GenBank 16S rRNA基因数据库中的参考序列进行比较以进行物种鉴定。生存筛选和机制测定中使用的细菌分离株/菌株的完整列表在补充材料中提供。

2.6. RNA干扰

从超低温冰箱中取出细菌菌株，置于冰上，并转移到紫外线灭菌的超净工作台。小心移开96孔板的盖子，剥开保护膜以定位所需的细菌菌株。使用无菌工具，挑取少量细菌并以S形划线在含有100 μg/mL氨苄青霉素的无菌LB琼脂平板上。密封平板并在37°C孵育8-12小时直至出现单菌落。然后将单个菌落接种到补充了氨苄青霉素的无菌LB液体培养基中，并在37°C、180 rpm下摇动培养15-18小时。随后，将接种了表达RNAi的细菌的NGM-IPTG平板倒置于25°C孵育16-20小时以诱导RNA干扰。在无菌条件下将同步化的L1期C. elegans转移到这些RNAi平板上，并在20°C下孵育。对于基于RNAi的比较，使用喂食空载体(EV)的N2动物作为对照。大约40小时后，线虫达到年轻成虫阶段，RNA干扰被认为完成。

2.7. C. elegans的寿命分析

在超净工作台的无菌条件下，将L1期线虫转移到接种了细菌（培养的肠道分离株）的9厘米NGM平板上，并在20°C下孵育40小时直至达到年轻成虫阶段。然后在清洁环境中用无菌M9缓冲液洗涤线虫，并转移到1.5 mL无菌离心管中，使其在重力作用下沉降。小心移去上清液，并重复洗涤过程3-5次直至悬浮液看起来澄清。然后将清洁的线虫转移到接种了细菌的6厘米NGM平板上，每板约30-50条线虫。随后进行寿命分析，并使用GraphPad Prism (9.5)生成生存曲线。

2.8. 用铜绿假单胞菌PA14感染C. elegans

在LB液体培养基中培养铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA14菌株。在无菌条件下，将300 μL细菌培养物转移到无菌的6厘米NGM-FUDR平板上，并在表面均匀涂布。除去多余液体，将平板风干、密封、倒置，并在37°C下孵育12小时，直至培养基完全被细菌覆盖并显示出特征性的绿脓菌素色素。然后将平板倒置于25°C下再孵育12小时。在无菌条件下收集先前在20°C下在接种了细菌的9厘米NGM平板上培养了48小时的成虫C. elegans。用无菌M9缓冲液洗涤线虫，并转移到1.5 mL无菌离心管中自然沉降。重复洗涤步骤3-5次直至上清液澄清。然后将清洁的线虫转移到准备好的铜绿假单胞菌PA14感染平板上，每板约50-60条线虫。每个实验组包括3-5个平板。将平板直立放置在25°C孵育，并每12小时监测一次线虫存活情况。记录死亡线虫的数量，直至所有个体死亡。汇总生存数据，并使用GraphPad Prism生成Kaplan-Meier生存曲线，每组包括三个重复平板。

2.9. 菌落形成单位(CFU)生物测定

在37°C摇动下，在BHI肉汤中培养植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)过夜，然后离心浓缩细菌悬浮液至所需密度用于喂养。制备标准NGM平板，使其凝固，随后接种R. planticola。在无菌条件下，将同步化的L1期C. elegans（包括mpk-1突变体和N2野生型菌株）转移到接种了R. planticola的9厘米NGM平板上，并在20°C下孵育48、66和96小时。孵育后，用无菌M9缓冲液洗涤线虫，并转移到1.5 mL无菌离心管中在重力作用下沉降。小心移去上清液，并重复洗涤步骤3-5次直至悬浮液看起来澄清。然后匀浆清洁的线虫以释放肠道相关细菌。将所得裂解液系列稀释并涂布在各种类型的琼脂培养基上。在37°C下孵育平板过夜，并计数菌落形成单位(CFU)以量化细菌载量。使用GraphPad Prism分析和可视化数据。

2.10. 使用大肠杆菌OP50和R. planticola的自噬生物测定

在BHI液体培养基中培养R. planticola，并在LB中培养大肠杆菌(Escherichia coli) OP50。在无菌条件下，将每种细菌培养物的200 μL等分试样分别转移到单独的无菌6厘米NGM平板上。将平板倒置并在25°C下孵育超过16小时以形成细菌菌苔。将同步化的L1期LGG-1::GFP转基因C. elegans转移到接种了R. planticola或E. coli OP50的9厘米NGM平板上，并在20°C下孵育36小时，直至线虫达到早期年轻成虫阶段。然后用无菌M9缓冲液洗涤线虫，并转移到1.5 mL无菌离心管中。沉降后，移去上清液，并重复洗涤过程3-5次直至溶液变澄清。为了固定线虫，加入少量10 mM左旋咪唑的M9缓冲液。然后将一滴线虫悬浮液置于显微镜载玻片上，盖上盖玻片，并在配备GFP滤光片的荧光显微镜下检查。荧光成像主要聚焦于肠道细胞以评估自噬活性。每组捕获30-50条线虫的图像，并使用ImageJ (1.54g)和GraphPad Prism (9.5)量化和比较处理组和对照组之间的自噬水平。

2.11. 产卵量生物测定

将L4期C. elegans转移到以植生拉乌尔菌(Raoultella planticola) (RP)或大肠杆菌(E. coli) OP50作为食物来源接种的NGM平板上，并在20°C下维持。在成虫第一天（第1天）开始的五天期间内，每天评估产卵量。为防止过度拥挤和交叉污染，每天将每条线虫转移到新鲜平板上。记录每只线虫每天产卵的总数，每个处理组至少包括10条线虫。该测定在生物学上重复三次，以确保数据的稳健性和可重复性。

2.12. RNA测序和转录组分析

在37°C摇动下，在LB和BHI肉汤中分别培养大肠杆菌(E. coli) OP50和R. planticola过夜，然后离心浓缩细菌细胞用于线虫喂养。在含有氨苄青霉素和四环素的LB中培养let-60 RNAi细菌菌株，并通过添加1 mM IPTG并在37°C下孵育4小时来进行RNAi诱导。制备标准NGM平板，并接种大肠杆菌(E. coli) OP50、R. planticola或let-60 RNAi细菌和R. planticola的1:1混合物。将这些平板在25°C下孵育16-20小时以形成细菌菌苔。将同步化的N2菌株C. elegans卵在M9缓冲液中孵化并生长至L1幼虫阶段，然后转移到准备好的NGM平板上。对于RNAi实验，将L1幼虫放置在含有let-60 RNAi/R. planticola混合物的平板上，并在20°C下孵育42小时，对照组是喂食空载体(EV)的N2。随后，用M9缓冲液彻底洗涤线虫以去除残留细菌，并转移到接种了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA14的平板上暴露24小时。感染期结束后，用M9缓冲液将线虫从平板上洗下进行收集，并将清洁的线虫转移到无菌微量离心管中。将样品在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C用于后续的转录组分析。

2.13. 统计分析

所有实验至少进行三个独立的生物学重复。使用GraphPad Prism (9.5)和R 4.3.3分析数据。对于两组之间的比较，当数据满足正态性和方差齐性假设时，使用双尾非配对Student's t检验。对于多组之间的比较，酌情使用单因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验（参数检验）或Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较校正（非参数检验）。PA14感染和寿命测定的生存数据使用Kaplan-Meier生存曲线进行分析，并使用log-rank (Mantel-Cox)检验进行比较。对于微生物组群落分析，使用Bray-Curtis距离计算β多样性，并通过PCoA/UMAP可视化。除非另有说明，结果以平均值±标准误(SEM)表示。在相关情况下应用多重检验校正（例如，LEfSe或转录组富集分析）。p < 0.05被认为具有统计学显著性。

3. 结果

3.1. 土壤、N2和五种免疫相关基因突变株之间微生物群落结构的相似性和变异

为了研究C. elegans肠道中的微生物群落，我们将N2野生型菌株和五种免疫相关基因突变体(mpk-1、atfs-1、egl-44、ced-3和hlh-30)的无菌L1幼虫引入土壤中。将这些线虫培养3到4天，直至成熟为成虫。收集土壤和线虫样本后，我们从土壤和六种线虫类型中提取DNA，以分析全长细菌16S rRNA基因。通过基于条形码的鉴定，从70个样本中生成了913,710条读长。每个样本最少生成8293条，平均生成13,053条环状共有序列(CCS)读长。我们鉴定了25个门、49个纲、123个目、227个科和533个属。在科水平上，土壤、N2菌株和不同突变体中的微生物群显示出显著差异。在土壤中，最主要的科是Xanthomonadaceae、Enterobacteriaceae和Rhizobiaceae。在N2菌株和突变体中，最主要的科是Enterobacteriaceae、Yersiniaceae、Lactobacillaceae和Weeksellaceae。在属水平上，总共注释了533个属，各组之间存在差异。属的相对丰度在野生型N2和突变株之间有所不同，并且在属水平上与土壤微生物群不同。然而，突变体与N2菌株高度相似，仅在属水平上存在微小差异。

3.2. 不同组别肠道微生物组的变化和多样性

使用了几种α多样性指标，包括丰富度、香农指数、Invsimpson、Chao1、辛普森指数、Pielou均匀度指数、丰度覆盖估计值(ACE)和Good's覆盖率，以研究不同组别之间不同ASV特征（即物种丰富度）的数量。总体结果表明，土壤样本呈现出最大的微生物多样性和丰富度。在五种突变株中，mpk-1突变体在S.obs（观测到的特征数）、Chao1、ACE、香农指数和Pielou指数上显示出最高值，反映了最丰富和最多样化的微生物群落。相比之下，hlh-30突变体在大多数指数上始终显示出最低的多样性。最高的辛普森指数在ced-3突变体中观察到，而hlh-30再次显示出最低值。这些结果表明，这些突变株的基因突变可能影响肠道微生物组，导致与野生型相比多样性发生改变。此外，主坐标分析(PCoA)和均匀流形近似与投影分析(UMAP)揭示了组间微生物群落的明显聚类，N2、土壤和突变株之间存在显著分离。N2组和土壤样本呈现出最明显的聚类，而突变株呈现出更多样化的模式，但在微生物组成上存在一些重叠。距离越大表明差异越大，表明突变体肠道中的微生物群落与其自然土壤栖息地中的群落有很大不同。LEfSe显示，在土壤样本中检测到的分类学生物标志物组数量最多，其次是mpk-1突变体，然后是egl-44和hlh-30突变体，这表明特定的肠道微生物群特征与不同组别相关。在egl-44突变体中发现的ASV数量为718，其次是atfs-1和mpk-1突变体，为706，接着是N2菌株，为646，然后是hlh-30和ced-3突变体。核心微生物组分析显示，所有组别共有144个ASV，在个别突变株(mpk-1、egl-44和ced-3)中观察到大量独特的ASV。具体来说，egl-44和mpk-1呈现出最多的独特ASV数量（分别为574和562），表明存在菌株特异性的微生物组特征。总之，这些结果表明，肠道微生物组的组成和多样性在不同突变株和土壤样本之间存在显著差异，在丰富度、多样性和群落结构上存在显著差异，尤其是在m