紫花苜蓿纤维粉调控妊娠母猪肠道菌群体外发酵的剂量效应及机制研究

《Microorganisms》：Nontuberculous Mycobacterium Peritonitis in Patients on Peritoneal Dialysis: A Scoping Review Hiroshi Tamura, Keishiro Furuie, Hiroko Nagata, Hitoshi Nakazato and Shohei Kuraoka

本研究通过体外发酵模型评估了不同剂量紫花苜蓿纤维粉（AFM）对妊娠母猪粪菌发酵特性、气体代谢、短链脂肪酸（SCFAs）产生及菌群结构的影响，揭示了AFM通过剂量依赖方式重塑肠道微生物群落、促进有益代谢、抑制有害代谢的潜力，为优化母猪日粮纤维利用提供了科学依据。

　　

引言：肠道菌群与膳食纤维

动物的肠道构成一个复杂的生态系统，容纳着数量庞大、基因多样性丰富的微生物群落。这些肠道菌群在维持宿主健康方面扮演着关键角色。在“后抗生素时代”，寻找安全有效的抗生素替代品已成为当务之急，而膳食纤维是能够通过多种机制调节肠道菌群的重要营养成分。紫花苜蓿纤维粉（AFM）通过茎叶分离技术获得，富含优质粗纤维以及必需维生素和矿物质，是一种有价值的营养补充剂。鉴于维持母猪的高成本以及获取肠道内容物样本的技术挑战，体外发酵成为研究AFM对妊娠母猪肠道菌群及其代谢产物影响的理想方法。本研究假设，AFM以剂量依赖的方式增加妊娠母猪肠道微生物的短链脂肪酸（SCFAs）产量并富集有益菌群。通过体外发酵，系统地评估了不同AFM添加水平对妊娠母猪粪便微生物组成和代谢谱的影响。

材料与方法

试验材料与设计

AFM来源于种植于河南农业大学新乡原阳试验基地的紫花苜蓿。将茎秆在80°C、控温避光条件下彻底干燥至恒重，研磨并通过1.00毫米筛网获得。发酵培养基参照文献方法配制，每升含有大豆蛋白胨、酵母提取物、粘蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、猪胆盐提取物及多种盐类和微量元素，调节pH至6.8后分装、灭菌。

试验选用四头健康经产DLY（杜洛克×长白×约克夏）杂交母猪，在无菌厌氧条件下，使用结肠取样法采集新鲜粪便样本制备10%粪菌悬液作为接种物。体外发酵试验采用批次培养法模拟猪结肠条件，分为四个处理组：CON（0 mg AFM）、LAFM（50 mg AFM）、MAFM（100 mg AFM）和HAFM（200 mg AFM）。将含有底物、培养基和接种物的血清瓶置于39 ± 0.5°C恒温培养箱中，分别发酵8、12、24和36小时。在发酵终点，使用气体分析仪测定气体（H₂、H₂S、CO₂、CH₄）产量。发酵上清液用于短链脂肪酸（SCFAs）测定，沉淀物用于16S rRNA基因测序分析微生物组成。使用Shimadzu GC-2010 Plus气相色谱仪分析SCFAs。通过16S rRNA基因V3-V4高变区扩增子测序，在Illumina MiSeq平台上进行测序，并使用97%相似度进行OTU聚类，基于Silva 138数据库进行物种注释，并计算α-多样性、β-多样性等指标。

结果

体外发酵产气动力学

AFM的添加显著影响了产气特性。总产气量和氢气产量随AFM添加水平和发酵时间的增加而显著增加。与CON组相比，所有AFM添加组在8、12和24小时的总产气量和氢气产量均显著更高。在36小时，MAFM和HAFM组仍保持显著更高的产量。甲烷产量在发酵早期（8小时和12小时）所有AFM组均显著高于CON组，但在发酵后期（24和36小时），仅HAFM组显示出甲烷产量的显著增加。相反，在整个发酵期间，所有AFM组的硫化氢产量均显著降低。二氧化碳产量在早期（8和12小时）仅在HAFM组显著升高，但在24和36小时，所有AFM组的产量均显著高于CON组。

短链脂肪酸谱

AFM的添加显著促进了短链脂肪酸（SCFAs）的产生。总SCFA浓度在所有发酵时间点均随AFM添加水平的增加而显著增加，并随时间推移而增加。具体而言，与CON组相比，AFM添加组的乙酸、丙酸和丁酸产量在大多数时间点均显著增加。丁酸产量在12小时无显著差异，但在其他时间点表现出显著的剂量依赖性效应。此外，在发酵中后期（24和36小时），AFM的添加也显著提高了支链脂肪酸（异丁酸和异戊酸）的产量，其中HAFM组的效果最为明显。戊酸的模式则不同，其在发酵早期（8和12小时）不受AFM影响，但在24和36小时，AFM组的浓度显著高于CON组。

微生物多样性模式

在OTU水平上进行韦恩分析显示，CON、LAFM、MAFM和HAFM组分别含有17、23、26和12个独特OTU，所有组共享40个OTU，表明存在所有处理共有的核心微生物群。对微生物α-多样性的进一步分析表明，AFM添加并未显著改变微生物的丰富度或均匀度，Sobs指数和Shannon指数在各处理组间均无显著差异。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）揭示了CON组与AFM添加组之间微生物群落结构的显著差异，CON样本与LAFM、MAFM和HAFM样本在主坐标轴上形成了明显分离的簇。

门水平和属水平群落结构

在门水平上，所有实验组的粪便微生物群落主要由厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门构成。厚壁菌门的相对丰度呈现剂量依赖性增加，从CON组的45.50%逐步增加到HAFM组的77.14%。相反，梭杆菌门的丰度从CON组的33.32%显著下降至所有AFM处理组的7.45%以下。此外，脱硫杆菌门和放线菌门存在于AFM添加组的微生物群中，但在CON组几乎检测不到。

统计比较显示，在门水平上存在显著的组间差异。HAFM组的放线菌门丰度显著高于其他三组。LAFM和MAFM组的脱硫杆菌门比例显著高于CON和HAFM组。与CON组相比，所有AFM添加组的未分类细菌类群比例均显著降低。绿弯菌门的丰度变化模式较为复杂，在LAFM组中显著高于CON组，但在MAFM和HAFM组中则显著受到抑制。

在属水平上，饮食中添加AFM引起了微生物群落的实质性组成变化。CON组的微生物群主要以梭菌属和乳杆菌属为特征。相比之下，AFM添加导致了乳杆菌属的逐步富集，在HAFM组中相对丰度达到53.40%。同时，其他几个属，包括普雷沃菌属、柯林斯菌属和巨型球菌属等在AFM处理组中的代表性也相较于对照组有所增加。

差异丰度分析进一步识别出受AFM添加显著改变的具体分类单元。多个属，包括柯林斯菌属、普雷沃菌属、氨基酸球菌属等，在所有三个AFM组中相较于CON组丰度均显著更高。脱硫弧菌属的丰度在LAFM和MAFM组中显著高于CON和HAFM组。相比之下，未分类细菌在CON组中的丰度显著高于任何AFM组，而梭状芽胞杆菌属在CON组中的丰度显著高于MAFM和HAFM组。

通过LEfSe分析识别微生物标志物

LEfSe分析（LDA得分 > 3.0）揭示了不同饮食方案下特征性的差异微生物标志物。CON组主要由几个未分类的类群定义。LAFM组中，脱硫弧菌属和梭状芽胞杆菌属作为重要的生物标志物出现。MAFM组表现出更复杂的生物标志物谱，其特征是柯林斯菌属、氨基酸球菌属、毛螺菌科中的norank_f__Muribaculaceae、普雷沃菌科NK3B31群和夏普氏菌属。值得注意的是，HAFM组由一个独特的生物标志物联合体表征，包括普雷沃菌属、霍尔德曼氏菌属、奥尔森菌属和三叶草菌属。这些结果表明，AFM添加诱导了微生物群落结构的剂量依赖性改变，特定的细菌类群可作为每个处理组的潜在生物标志物。

微生物属与发酵参数之间的相关性分析

相关性分析揭示了差异丰度微生物属与关键发酵参数（包括产气和SCFAs浓度）之间的显著关联。总SCFAs浓度与多个属（包括柯林斯菌属、普雷沃菌属、霍尔德曼氏菌属和奥尔森菌属）呈强正相关，并且与氨基酸球菌属呈显著正相关。相比之下，总SCFAs与梭状芽胞杆菌属的丰度呈负相关。产气参数也表现出显著的微生物相关性。H₂产量与柯林斯菌属、普雷沃菌属和奥尔森菌属呈强正相关，并且与氨基酸球菌属和霍尔德曼氏菌属呈显著正相关。相反，H₂S产量与普雷沃菌属和夏普氏菌属呈显著负相关。这些相关性模式表明，AFM诱导的特定微生物种群（尤其是柯林斯菌属、普雷沃菌属和奥尔森菌属的富集）变化与增强的碳水化合物发酵能力相关，这反映在增加的SCFAs产量和氢气生成上。

讨论

本研究系统探讨了不同梯度水平的AFM对妊娠母猪来源微生物的体外发酵特性、微生物群落结构和代谢谱的影响。结果表明，AFM添加在产气、SCFAs谱和微生物组成方面诱导了剂量依赖性调节，揭示了一个增强纤维发酵与微生物生态系统优化相一致的清晰模式。

微生物代谢膳食纤维过程中产生的气体可作为结肠发酵状态和肠道生态动力学的重要指标，也参与调节肠道生理功能。在本研究中，随着AFM水平和发酵时间的增加，总产气量以及H₂和CO₂产量总体增加，表明底物可及性增强以及碳水化合物发酵相关途径被激活。CO₂通常来源于碳水化合物的分解和脱羧过程，而H₂主要反映发酵过程中还原当量的释放和转移，两者同时增加可被视为微生物能量代谢增强和群落整体发酵速率提高的证据。值得注意的是，在发酵早期，所有AFM组的甲烷产量均显著增加，但这种差异随时间推移而减弱。甲烷的形成依赖于产甲烷古菌利用CO₂，因此其早期增加可能表明AFM在初始阶段迅速释放可发酵底物，导致发酵产生的H₂增加，从而为产甲烷菌提供了充足的底物，并在短期内赋予其竞争优势。更重要的是，所有AFM组都持续抑制了H₂S的生成。由于H₂S通常与含硫氨基酸的降解和硫酸盐还原有关，其减少通常被认为反映了微生物代谢从蛋白质水解相关途径向碳水化合物利用的转变。此外，H₂S在较高水平下可能损害肠上皮细胞的线粒体功能，削弱黏膜屏障并引发炎症反应，因此AFM对H₂S的抑制作用表明其可能通过减少蛋白质发酵和有毒代谢物积累来改善肠道微环境。

在体外发酵系统中，短链脂肪酸（SCFAs）是最重要且最常检测到的末端代谢产物之一。它们不仅反映了微生物利用碳水化合物的程度，也是评估微生物群功能产出的关键指标，并与益生菌增殖和代谢活性密切相关。与产气动力学的变化一致，AFM添加以剂量和时间依赖的方式显著促进了SCFA的产生。微生物发酵是SCFAs的主要来源，而SCFAs被认为是肠道健康的重要介质，SCFAs的持续积累可被视为AFM改善发酵环境和增强功能性代谢产出的直接证据。总SCFA浓度的逐渐增加表明AFM有效提高了碳水化合物发酵的效率。这一过程通常伴随着管腔酸化和pH值降低，这在生态位水平上抑制了某些酸敏感的潜在病原体，同时为产酸细菌提供了更有利的竞争条件。此外，SCFAs不仅是结肠上皮细胞的重要能量底物，还可以通过调节黏膜屏障完整性和影响免疫信号通路来发挥抗炎和免疫调节作用。在组成方面，最丰富的SCFA——乙酸在所有AFM组中均显著高于对照组，表明AFM中的膳食纤维能够快速进入初级发酵途径，并可能为后续高碳SCFAs的积累提供代谢基础。丁酸和丙酸在发酵后期达到显著水平，且在所有AFM处理组中浓度更高，表明不同SCFAs的最佳合成通常取决于特定底物的可用性和群落结构的时间演替。戊酸的生成通常被认为与其他SCFAs的进一步转化或特定底物的二次发酵有关，可能反映了发酵已进入更深的代谢阶段。异丁酸和异戊酸大多与支链氨基酸的发酵有关，通常被视为蛋白质发酵增强的指标，这也解释了它们为何仅在后期时间点才显著增加。

这种优化的发酵代谢模式与微生物群落结构的重塑密切相关。尽管AFM并未改变样本内的α-多样性，但它显著重塑了微生物群落组成。主坐标分析揭示了CON组和AFM组之间的明显分离，证实了AFM改变肠道微生物群落结构的能力。在门水平上，厚壁菌门的比例呈剂量依赖性增加，成为优势菌门。拟杆菌门的显著增加表明该门作为SCFAs的主要生产者，在维持肠道健康方面发挥了重要作用。同时，梭杆菌门与疾病密切相关，我们发现其丰度的显著降低表明了AFM在抑制有害微生物种群方面的潜力。此外，放线菌门丰度的增加进一步强调了AFM在促进更健康的微生物群落结构方面的作用。

在属水平上，这些门水平的变化表现为特定功能菌群的富集或抑制。乳酸菌的显著增加通过产生乳酸抑制病原菌的生长，从而改善肠道健康。梭菌属物种与胃肠道疾病呈正相关，而本实验发现梭菌属物种显著减少，表明AFM促进了有益菌生长的同时抑制了有害菌的增殖。柯林斯菌属丰度的升高，以及普雷沃菌属、奥尔森菌属和霍尔德曼氏菌属的富集，均随AFM水平的增加呈梯度增加，表明微生物群落正在适应和专门化于膳食纤维的降解。这些菌属与SCFA和氢气产量的强正相关性进一步巩固了它们在AFM发酵过程中的核心作用。

总之，AFM通过剂量依赖的方式，促进气体和短链脂肪酸（SCFA）的生成，增加有益菌丰度并抑制有害菌，改善了妊娠母猪肠道微生物的发酵特性。在本实验条件下，100 mg被确定为该发酵添加剂在妊娠母猪中应用时更为平衡的补充水平，主要适用于妊娠母猪；其对于其他生理阶段的适用性仍有待未来研究中进一步验证。