《Microorganisms》：Effects of Alfalfa Fiber Meal on the In Vitro Fermentation Characteristics and Community Structure of the Colonic Microbiota of Sows
Shuhang Zhang,
Ruicheng Yu,
Congbin Chen,
Zhichang Wang,
Xiaoyan Zhu,
Yalei Cui,
Boshuai Liu and
Yinghua Shi
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本文研究了苜蓿纤维粉对妊娠母猪结肠微生物的体外发酵特性、微生物群落结构及代谢产物的影响。结果表明，AFM可促进短链脂肪酸（SCFA）生成，并显著富集乳酸杆菌、普雷沃菌等有益菌，同时抑制有害菌。研究发现100 mg AFM添加量是较均衡的补充水平，为改善妊娠母猪肠道健康提供了理论支持。
摘要
肠道菌群在单胃动物的后肠健康和营养利用中起着关键作用。苜蓿纤维粉富含必需维生素和矿物质，是一种有价值的营养补充剂。本研究以健康妊娠母猪的粪便菌群为接种物，建立了体外发酵模型，以评估不同添加水平的苜蓿纤维粉对发酵代谢产物和微生物群落组成的影响，并特别关注菌群与代谢物之间的相互作用。研究采用低、中、高三个添加水平，发酵8、12、24和36小时后收集样本，分析产气量和短链脂肪酸浓度。微生物群落组成在36小时进行分析，并进行优势菌属与发酵参数的相关性分析。结果表明，总产气量和氢气产量随AFM添加水平和发酵时间显著增加，而硫化氢产量在所有处理中均下降。甲烷产量在发酵早期升高，但仅在高剂量组保持较高水平。AFM的添加以剂量和时间依赖性的方式促进了总短链脂肪酸和单个短链脂肪酸的产量。微生物分析显示，Fusobacterium减少，Lactobacillus、Bacteroides和Collinsella增加，高剂量AFM进一步富集了Prevotella和Megasphaera。短链脂肪酸产量与Collinsella、Prevotella和Olsenella呈正相关，而硫化氢产量与Prevotella和Sharpea呈负相关。AFM有效改善了肠道微生物组成和发酵效率，在体外条件下，100 mg被认为是用于妊娠母猪的更为均衡的发酵添加剂补充水平。
引言
动物肠道是一个复杂的生态系统，其内寄居着庞大的微生物群落，在数量和遗传多样性上均超过宿主细胞。这些肠道微生物与宿主进行复杂的相互作用，在维持宿主健康方面起着至关重要的作用，而菌群失调则可能引发多种病理状况。因此，调节肠道菌群已成为医学和农业科学的重要研究焦点。近年来，粪菌移植作为一种调节肠道菌群的创新治疗方法获得认可。然而，FMT的广泛应用面临着供体变异性等问题。在此背景下，体外发酵技术为大规模、标准化的肠道菌群培养提供了一个新平台。随着全球畜牧业进入“后抗生素时代”，寻找安全有效的抗生素替代品成为当务之急。膳食纤维是可通过多种机制调节肠道菌群的重要营养成分。苜蓿纤维粉是一种宝贵的营养补充剂，富含优质粗纤维、必需维生素和矿物质。本研究采用体外发酵方法，系统评估了不同AFM添加水平对妊娠母猪粪便微生物组成和代谢谱的影响。
材料与方法
测试材料
AFM来源于河南农业大学新乡原阳试验基地种植的苜蓿。新鲜植株经茎叶分离后进行形态和营养成分分析。茎秆在80 °C下避光烘干至恒重，研磨过1.00 mm筛获得AFM。发酵培养基根据方法配制，包含大豆蛋白胨、酵母提取物、粘蛋白、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、猪胆盐提取物、多种无机盐等成分。培养基pH调节至6.8，分装至西林瓶中灭菌。实验选取四头健康的经产DLY（杜洛克×长白×大白）杂交母猪，采集新鲜粪便样品，在厌氧条件下制备成10%的粪便悬浮液作为接种物。实验分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组四个重复，在39 ± 0.5 °C下分别发酵8、12、24和36小时。发酵结束后，进行气体成分分析，上清液用于测定短链脂肪酸，沉淀物用于16S rRNA测序分析。
结果
体外发酵气体动力学
体外发酵表明，AFM的添加显著影响了产气特性。总产气量和氢气产量随AFM添加水平和发酵时间的增加而显著增加。与对照组相比，所有AFM添加组在8、12和24小时的总产气量和氢气产量均显著更高。在36小时，中、高剂量组保持了显著升高的产量。甲烷产量在发酵早期在所有AFM组均显著高于对照组，但在发酵后期，仅高剂量组的甲烷产量保持显著升高。硫化氢产量在整个发酵期间在所有AFM组均显著降低。二氧化碳产量仅在发酵早期的高剂量组显著升高，但在24和36小时，所有AFM组的二氧化碳产量均显著高于对照组。
短链脂肪酸谱
AFM的添加显著促进了短链脂肪酸的生成。总短链脂肪酸浓度在所有发酵时间点均随AFM添加水平的增加而显著增加，并随时间推移而增加。具体而言，与对照组相比，AFM添加组在大多数时间点的乙酸、丙酸和丁酸产量均显著增加。丁酸产量在12小时无显著差异，但在其他时间点显示出显著的剂量依赖性效应。此外，支链脂肪酸（异丁酸和异戊酸）的产量在发酵中后期也因AFM的添加而显著升高，在高剂量组效果最为明显。戊酸的模式则不同，其在发酵早期不受AFM影响，但在24和36小时，AFM组的浓度显著高于对照组。
微生物多样性模式
在OTU水平的韦恩分析显示，对照组、低、中、高剂量组分别有17、23、26和12个独特的OTU。所有处理组共享40个OTU。AFM的添加并未显著改变微生物的丰富度或均匀度。基于Bray–Curtis距离的主坐标分析显示，对照组与AFM添加组之间的微生物群落结构存在显著差异，对照组样本与AFM处理样本在主坐标上形成了明显的分离。
门水平和属水平分类群群落结构
在门水平，所有实验组的粪便微生物群落主要由厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门构成。随着AFM剂量的增加，厚壁菌门的相对丰度呈剂量依赖性增加，而梭杆菌门的丰度则大幅下降。此外，脱硫菌门和放线菌门在AFM添加组中存在，但在对照组中几乎检测不到。在属水平，对照组的微生物群落以Clostridium和Lactobacillus为主。AFM的添加导致了Lactobacillus的逐渐富集，在高剂量组相对丰度达到53.40%。同时，Prevotella、Collinsella和Megasphaera等属在AFM处理组中的比例也有所增加。差异丰度分析进一步确定了受AFM添加显著改变的特定类群。多个属在AFM组中的丰度显著高于对照组。相比之下，未分类细菌在对照组中的丰度显著高于任何AFM组。
LEfSe分析鉴定微生物生物标志物
LEfSe分析揭示了与不同膳食方案相关的不同微生物生物标志物。对照组主要由几种未分类的分类群定义。低剂量组中，Desulfovibrio和Cloacibacillus成为重要的生物标志物。中剂量组显示出更复杂的生物标志物谱，包括Collinsella、Acidaminococcus等。值得注意的是，高剂量组由一组独特的生物标志物组成，包括Prevotella、Holdemanella、Olsenella和Mitsuokella。
微生物属与发酵参数的相关性分析
相关性分析揭示了差异丰度微生物属与关键发酵参数之间的显著关联。总短链脂肪酸浓度与Collinsella、Prevotella、Holdemanella和Olsenella呈强正相关，与Acidaminococcus呈显著正相关，而与Cloacibacillus丰度呈负相关。氢气产量与Collinsella、Prevotella和Olsenella呈强正相关，与Acidaminococcus和Holdemanella呈显著正相关。相反，硫化氢产量与Prevotella和Sharpea呈显著负相关。
讨论
本研究系统地探讨了不同梯度水平的AFM对妊娠母猪粪便微生物体外发酵特性、菌群结构和代谢谱的影响。结果显示，AFM的添加引起了产气、短链脂肪酸谱和微生物组成的剂量依赖性变化。在发酵过程中，随着AFM水平和发酵时间的增加，总产气量以及H2和CO2产量总体增加，表明底物可及性增强和碳水化合物发酵相关途径被激活。值得注意的是，在发酵早期，所有AFM组的甲烷产量均显著增加，但这种差异随时间推移而减小。更重要的是，所有AFM组均持续抑制了H2S的产生。AFM的添加以剂量和时间依赖性的方式显著促进了短链脂肪酸的生成。总短链脂肪酸浓度的逐渐增加表明AFM有效提高了碳水化合物发酵效率。在成分上，乙酸在所有AFM组中均显著高于对照组。丁酸和丙酸在发酵后期达到显著水平，且在AFM处理组中浓度更高。这种优化的发酵代谢模式与微生物群落结构的重塑密切相关。在门水平，厚壁菌门的比例呈剂量依赖性增加，使其成为优势门。拟杆菌门显著增加，而梭杆菌门与疾病密切相关，其丰度的显著降低表明了AFM在抑制有害微生物种群方面的潜力。在属水平，乳酸杆菌的显著增加通过产生乳酸抑制了病原菌的生长。梭菌属显著减少，而Collinsella、Prevotella、Olsenella和Holdemanella的丰度均随着AFM水平的升高而梯度增加，表明微生物群落正在适应并专门用于膳食纤维的降解。这些属与短链脂肪酸和氢气产量的强正相关性进一步强化了它们在AFM发酵过程中的核心作用。
综上所述，AFM通过促进产气和短链脂肪酸生成、增加有益菌丰度、抑制有害菌，剂量依赖性地改善了妊娠母猪肠道微生物的发酵。在本实验条件下，100 mg被确定为适用于妊娠母猪的这种发酵添加剂更均衡的补充水平，主要适用于妊娠母猪；其对于其他生理阶段的适用性仍有待未来研究进一步验证。
