《Plants》：Methylome and Transcriptome Analysis Reveals Differences in Callus Development and Plantlet Regeneration Capacity Between Two Eucalyptus Species
Bowen Chen,
Chunyan Gan,
Shengkan Chen,
Dongqiang Guo,
Guichan Liang,
Xiaoying Fang,
Hui Zhu,
Ziyu Deng,
Qinglan Tang and
Changrong Li
+ 2 authors
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本文通过整合甲基组与转录组分析，系统揭示了赤桉与巨尾桉杂交种在体细胞胚胎发生过程中愈伤组织发育与植株再生能力存在显著差异的表观遗传学基础。研究发现，两种桉树的差异表达基因（DEGs）在植物激素信号转导和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路中显著富集，并鉴定出AHP、BAK1、CRE1等一系列关键调控基因。该研究为理解木本植物再生障碍机制及优化其高效再生体系提供了重要的分子依据。
本研究题为“甲基组与转录组分析揭示两种桉树种在愈伤组织发育及植株再生能力差异”，旨在探究赤桉（Eucalyptus camaldulensis，高胚胎发生潜力）与巨尾桉杂交种（E. grandis × urophylla，低胚胎发生潜力）在愈伤组织发育过程中再生能力差异的分子与表观遗传机制。
引言
桉树是桃金娘科（Myrtaceae）中多样性极高的属，在全球范围内广泛种植，具有生长快、生物量大、适应性强等优点。然而，其有性繁殖周期长，无性繁殖（特别是通过体细胞胚胎发生（SE）的离体组织培养）又常因基因高度杂合而面临再生障碍的挑战。愈伤组织的发育是离体植株再生过程中的关键环节，涉及复杂的分子与表观遗传变化。尽管在拟南芥等模式植物中已有研究，但桉树不同物种间再生能力差异的表观遗传基础，尤其是DNA甲基化的调控机制，仍不明确。
结果
2.1. 愈伤组织诱导与培养
对两种桉树的茎段进行离体组织培养，获得了不同发育阶段的愈伤组织，包括初级愈伤组织（pri-callus）、成熟愈伤组织（mat-callus）、芽再生阶段愈伤组织（SRS-callus）和衰老愈伤组织（sen-callus）。在形态学上，各阶段愈伤组织外观无显著种间差异。然而，石蜡切片组织学分析显示，当成熟愈伤组织转移到芽诱导培养基（SIM）上培养5天和10天后，赤桉中再生芽的数量显著多于巨尾桉杂交种，这表明两者在芽再生诱导阶段存在显著的再生能力差异。
3、ABA、ZR和IAA水平。">
2.2. 两种桉树的生理差异
在芽再生阶段，赤桉的芽再生诱导率显著高于巨尾桉杂交种。对成熟愈伤组织内源激素含量的测定发现，赤桉中的生长素（IAA）、脱落酸（ABA）和赤霉素GA3水平均显著高于巨尾桉杂交种。这表明观察到的激素差异可能与两种物种间再生潜力差异相关。
2.3. 愈伤组织成熟过程中的全基因组DNA甲基化
对两种桉树不同发育阶段愈伤组织进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），分析了CG、CHG、CHH三种序列上下文中的甲基化水平。聚类分析显示，在启动子区域，巨尾桉杂交种的甲基化水平（尤其是在CG背景下）显著高于赤桉。对差异甲基化区域（DMRs）及相关基因（DMGs）的KEGG通路富集分析发现，基因体区域的DMGs主要富集于苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成等通路；而启动子区域的DMGs则主要富集于植物-病原互作和氨基酸代谢通路。值得注意的是，所有三个阶段（初级、成熟、SRS-callus）的DMR相关基因均在倍半萜和三萜生物合成通路中显著富集。
2.4. 甲基组与转录组的联合分析
为了探究DNA甲基化与基因表达的调控关系，对在巨尾桉杂交种中呈现“高甲基化-低表达”或“低甲基化-高表达”协同变化的基因进行了通路富集分析。在SRS-callus阶段，“低甲基化-高表达”的基因在植物激素信号转导通路中显著富集。在初级和成熟愈伤组织阶段，植物-病原互作通路在“高甲基化-低表达”和“低甲基化-高表达”两组基因中均被富集。
具体到植物激素信号转导通路，与玉米素、二萜、类胡萝卜素、油菜素内酯生物合成以及苯丙氨酸代谢相关的基因，其在启动子甲基化水平和基因表达上均在两种桉树间存在显著差异。研究重点追踪了多个关键基因的动态变化，例如细胞分裂素受体基因CRE1、组氨酸含磷酸转运蛋白基因AHP、 BRI1关联受体激酶1基因BAK1、油菜素内酯信号激酶基因BSK、触摸诱导蛋白4基因TCH4、MAP激酶4底物1基因MKS1以及呼吸爆发氧化酶同源物D基因RbohD等。这些基因在两种桉树不同发育阶段的甲基化与表达模式呈现复杂且特异的差异。
通过qRT-PCR对AHP、BAK1、BSK、CRE1、GID1、MKS1、PR-1、PYL、RbohD和TCH4这十个关键基因的表达进行了验证，结果与RNA-seq数据趋势基本一致，独立证实了这些候选基因的表达具有阶段特异性和种间依赖性。
讨论
本研究通过整合甲基组与转录组分析，揭示了激素信号是调控两种桉树愈伤组织发育和植株再生能力差异的关键。构建了一个连接激素含量差异、启动子甲基化差异、基因表达差异与再生能力差异的综合调控模型。
研究发现，在愈伤组织发育过程中普遍存在全基因组低甲基化现象，这与之前在其他物种中的报道一致。倍半萜和三萜生物合成通路可能通过甲基化调控参与愈伤组织发育，而这些化合物是ABA、JA、IAA等内源激素的前体。植物-病原互作通路也通过甲基化调控愈伤组织再生，这与在其他物种中的发现相符。
差异表达基因（DEGs）在植物激素信号转导和MAPK信号通路中显著富集。MAPK级联反应是 eukaryotes 中重要的信号模块，参与乙烯、JA、ABA等多种植物激素的生物合成和/或信号传递，并能调控激素的生物合成与运输。本研究中这两个通路的共现，很可能是因为MAPK信号通路调控了植物激素信号转导。
对关键基因功能的探讨表明：CRE1作为细胞分裂素受体，在器官从头形成和生长调控中起重要作用；BAK1与BSK参与油菜素内酯信号转导，并能激活MAPK通路；TCH4作为木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶（XTH）家族成员，在细胞壁稳态中起关键作用，其高表达可能与再生阶段活跃的细胞壁合成有关；MKS1是MAPK4的底物蛋白；RbohD则能促进活性氧（ROS）迸发，从而增强MAPK的长时程激活。这些基因的协同调控是造成赤桉与巨尾桉杂交种愈伤组织再生能力差异的关键因素。
材料与方法
研究材料为赤桉和巨尾桉杂交种的离体培养苗。通过在不同培养基（CIM和SIM）上培养，系统获得了五个发育阶段的组织样品用于分析。采用石蜡切片进行组织学观察，利用高效液相色谱（HPLC）测定内源激素含量。通过WGBS进行全基因组DNA甲基化测序，并与课题组前期的转录组数据（NCBI SRA登录号PRJNA761197）进行整合分析。利用生物信息学方法鉴定DMRs、DMGs和DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。最后，通过qRT-PCR对关键基因的表达进行验证。
结论
本研究揭示了甲基化介导的植物激素信号和MAPK通路调控是桉树再生能力变异的关键机制。整合分析表明，AHP、BAK1、BSK、CRE1等基因主要富集于植物激素信号转导和MAPK信号通路，在愈伤组织发育和再生能力中扮演关键角色。这些发现不仅增进了对桉树愈伤组织发育的理解，而且为未来通过靶向调控甲基化以增强激素和MAPK信号效率来改善再生提供了战略方向。对这些已鉴定基因进行功能验证将是阐明其在再生中精确作用、支持开发优化桉树再生的靶向生物技术策略的必要后续步骤。
