《Journal of Fungi》：Identification and Characterization of Pathogenic Fusarium Species Causing White Mold Disease in Cultivated Morels (Morchella spp.) in China
Luzhen Wang,
Qi Zhao,
Muqing Bai,
Yongwei Wang,
Keling Liu,
Rujia Liang,
Frederick Leo Sossah,
Odeshnee Naicker and
Chunlan Zhang
编辑推荐：
本综述首次在中国栽培羊肚菌中系统鉴定了12种可致白霉病的镰刀菌，明确了其地理分布和致病力差异，为羊肚菌产业的靶向监测与病害管理策略提供了关键科学依据。
1. 引言
羊肚菌(Morchellaspp.)是羊肚菌科、盘菌目中备受推崇的食用子囊菌，以其独特风味、营养和药用价值而闻名。其生物活性成分包括氨基酸、腺苷、维生素和多糖，现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、免疫调节、肝保护和降血糖活性。鉴于其极高的经济潜力，羊肚菌的人工栽培已引起全球日益增长的兴趣。2012年，中国开始了羊肚菌的大田栽培，并迅速发展，到2021年栽培面积已达约10,667公顷。中国主要栽培的羊肚菌种类包括M. importuna、M. sextelata和M. septimelata，其中M. sextelata占全国栽培面积的85%以上。
然而，在大规模栽培过程中，真菌病害是导致产量和品质下降的主要挑战。每年，约25%的总栽培面积受到病害爆发的影响。多种真菌病原菌已被证实与羊肚菌病害相关，其中包括引起白霉和菌盖腐烂的Neonectria candida、Paecilomyces penicillatus和Pseudodiploospora longispora。其他已报道的病原菌还包括引起菌柄腐烂的Fusarium incarnatum、引起茎腐病的Fusarium nematophilum，以及多种Clonostachys、Lecanicillium和Trichoderma菌种。此外，蛛网病也与Cladobotryum和Hypomyces菌种有关。
这些多样的病原菌通常在羊肚菌子实体上产生密集的白色绒毛状菌丝体过度生长，统称为白霉病。在高湿和高温等有利环境条件下，白霉病可迅速传播，导致严重的生产损失。目前，白霉病被认为是影响羊肚菌栽培最具破坏性的病害。尽管已有研究利用高通量ITS扩增子测序等技术鉴定出P. longispora和Clonostachys solani是白霉病的常见病原菌，但元条形码技术存在局限性，尤其是在区分近缘种方面。因此，需要使用纯培养物和多基因系统发育分析进行全面的病原菌鉴定。
针对这些局限性，本研究旨在对影响M. sextelata的白霉病相关镰刀菌进行全面的调查。具体目标是：(1) 从中国不同栽培基地收集的有症状羊肚菌子实体中分离和鉴定镰刀菌种类，利用形态学和多基因系统发育分析；(2) 在受控条件下评估代表性分离株的致病力；(3) 评估种间的毒力差异，以阐明其在白霉病流行病学中的作用。本研究揭示了羊肚菌栽培病害相关镰刀菌的物种多样性和致病潜力，为制定有针对性的羊肚菌可持续生产防控策略提供了重要基础。
2. 材料与方法
2.1. 野外调查与采样
在2023年至2025年间，对中国16个主要羊肚菌产区的22个栽培基地进行了针对羊肚菌白霉病的野外调查。调查范围覆盖了甘肃、黑龙江、河北、河南、湖北、内蒙古、江苏、吉林、辽宁、青海、陕西、山东、山西、四川、天津和云南。采样点选择基于存在表现出白霉病症状的有症状羊肚菌子实体。总计收集了832个有症状的子实体。所有样本均置于无菌塑料袋中，冰上运输，并在实验室分析前储存于4°C。
2.2. 真菌分离与培养
采用两种互补的方法获得真菌分离株。对于产孢的样本，切取成熟的孢子体（如分生孢子梗、子囊壳）并悬浮在无菌水中制备孢子悬液。经系列稀释（10?1至10?4）后，将150 μL每种悬液一式三份涂布在添加了100 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL链霉素以抑制细菌污染的水琼脂上。在25°C培养24–36小时后，将萌发的孢子单个转移到含有相同抗生素浓度的马铃薯葡萄糖琼脂上。通过将单菌落传代到新鲜的PDA上建立纯培养物。
对于没有可见孢子的样本，采用改进的组织分离法。从病健组织交界处切取约3 × 3 mm的组织块，依次在70%乙醇中表面消毒1分钟，然后在1% NaClO中消毒1分钟，最后在无菌蒸馏水中冲洗三次。在无菌滤纸上干燥后，将组织块置于半强度PDA-AS上，并在25°C下培养。将新长出的菌丝尖端转移到PDA上以建立纯培养。所有分离株和参考标本均保存在中国长春大学真菌培养物保藏中心。
2.3. 形态学鉴定
基于宏观和微观特征进行形态学表征。在黑暗条件下，于25°C在PDA上培养7天后，评估菌落形态、色素沉着和生长速率。菌落颜色参照Methuen色彩手册。使用康乃馨叶琼脂和PDA观察微观形态特征，包括孢子座的存在和结构、分生孢子梗、瓶梗、气生和孢子座分生孢子以及厚垣孢子。样品用水装片，在配备微分干涉差（DIC）光学系统的卡尔蔡司Axioscope 5显微镜下观察，并使用卡尔蔡司Axiocam 712单色数码相机拍摄图像，每个结构至少测量30次。
2.4. DNA提取、PCR扩增和测序
使用植物DNA提取试剂盒从在25°C PDA上培养7天的每个分离株培养物中提取基因组DNA。针对四个基因位点进行扩增：使用引物ITS4/ITS5扩增内转录间隔区（ITS）区域；使用引物CL1/CL2A扩增钙调蛋白（CaM）基因；使用引物EF-1/EF-2扩增翻译延伸因子1-α（tef1）基因；使用引物fRPB2-5F2/7cR扩增RNA聚合酶II第二大亚基（rpb2）基因。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，并由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。使用PhyloSuite v1.2.3软件编辑和组装序列。所有新生成的序列均提交至GenBank。
2.5. 系统发育分析
通过将ITS序列与NCBI GenBank数据库进行BLASTn比对，对所有分离株进行初步鉴定。为了进行准确的物种水平鉴定，使用包含ITS区域、tef1、CaM和rpb2的多位点数据集，对代表性分离株子集进行系统发育分析。从GenBank检索镰刀菌属物种的模式或前模式菌株的参考序列。使用MAFFT在PhyloSuite v1.2.3中对多个序列（ITS、tef1、CaM和rpb2）进行比对，并在必要时进行手动校正。然后，使用最大似然法和贝叶斯推断法对在PhyloSuite v1.2.3中拼接的序列（ITS、tef1和rpb2）进行系统发育分析。具体而言，使用组合的CaM、rpb2和tef1数据集对TJS-16-2及相关菌株进行系统发育分析。TJS-16-2的CaM基因序列在GenBank中的登录号为PQ595068。选择CaM基因是因为它是镰刀菌物种鉴定的核心条形码，并为区分包括TJS-16-2等易误认菌株在内的近缘类群提供了高分辨率。
2.6. 致病力测定
为了确定从患病羊肚菌子实体中分离的12种镰刀菌是否均具有致病性，根据柯赫氏法则进行了致病性验证。从12种镰刀菌中各选择一个菌株作为测试分离株。每个分离株在PDA上于25 ± 1°C黑暗条件下培养14天以获得活跃的菌丝生长。用无菌蒸馏水冲洗菌落，用纱布过滤孢子悬液，并使用血球计数板将孢子浓度调整至1 × 106个/mL。然后将10 μL孢子悬液滴加到菌柄表面。以无菌水作为对照。每个分离株接种到三个独立的M. sextelata子实体上，然后将其转移至人工气候室，在18°C、90%相对湿度的黑暗条件下培养。接种后每天监测症状发展情况。接种后4天，使用数字卡尺测量病斑平均直径。为完成柯赫氏法则，从有症状组织中切取组织块，表面灭菌后重新培养在PDA上。通过形态学检查和ITS区域测序确认重新分离的真菌身份。所有测定均进行三次生物学重复，并重复两次实验以验证可重复性。
2.7. 数据分析
使用SPSS v27软件对致病力数据进行单因素方差分析。在进行方差分析之前，进行了正态性和方差齐性检验。病斑大小的多重比较在p < 0.05水平上使用Duncan多重比较检验进行。因为各组样本量相等且处理数量相对较多，Duncan检验因其效率和对当前分析的适用性而被选用。使用Origin 2024软件对图形数据（例如病斑大小分类）进行可视化。
3. 结果
3.1. 症状描述与调查结果
田间观察到的症状在各采样点表现一致，包括密集、白色、绒毛状的菌丝体过度生长、子实体过早萎蔫、腐烂和坏死病斑，这与健康的子实体形成对比。
根据野外调查结果和分子鉴定，镰刀菌物种的存在和多样性因地区而异。与中国南方省份相比，黑龙江、陕西、河北等北方和北方中部省份表现出更高的物种丰富度和分离频率。镰刀菌菌株分离自黑龙江、河北、甘肃、青海、山西、山东、河南等省以及天津市的羊肚菌栽培基地。相比之下，在调查的16个省市中，未从吉林、辽宁、陕西、湖北、四川、云南、江苏等省或内蒙古自治区获得镰刀菌分离株。每个采样点的饼图说明了每种已鉴定的镰刀菌物种的相对丰度。值得注意的是，F. acuminatum和F. verticillioides分布广泛，并从多个地点频繁分离到。
3.2. 分子鉴定
对从有症状羊肚菌子实体获得的120个分离株的ITS序列进行BLAST分析，结果显示所有分离株均属于镰刀菌属。为了鉴定到物种水平，首先根据菌落形态和微观形态特征对分离株进行分组。然后，从每组中选出代表性分离株，并考虑其地理分布，使得分离频率较高的地点的分离株能按比例被代表。总共选择了27个代表性分离株，使用ITS、tef1、CaM和rpb2序列进行多基因系统发育分析。包含在系统发育分析中的参考物种属于相同的物种复合群，并且基于tef1序列比较，与未鉴定分离株具有高度的系统发育相关性，从而提高了物种定界的稳健性。
拼接的系统发育树（ITS-tef1-rpb2和CaM-tef1-rpb2）解析出12个不同的镰刀菌物种：F. acuminatum、F. avenaceum、F. clavum、F. compactum、F. falciforme、F. flocciferum、F. ipomoeae、F. mucidum、F. oxysporum、F. proliferatum、F. subglutinans和F. verticillioides。这些物种被归入五个镰刀菌物种复合群，即F. tricinctum物种复合体（FtSC）、F. oxysporum物种复合体（FoCS）、F. fujikuroi物种复合体（FfSC）、F. solani物种复合体（FsSC）和F. incarnatum-equiseti物种复合体（FieSC）。在大多数节点观察到较高的统计支持度，最大似然法自展值≥ 70%，贝叶斯后验概率≥ 0.90。使用Fusarium concolor NRRL 13459和Bisifusarium aseptatum LC1075作为外类群来为进化树定根。
70%) and Bayesian posterior probabilities (BI-PP > 0.9) are indicated at nodes (BI-PP/ML-BS).">
3.3. 形态学特征
从有症状的M. sextelata子实体中分离的十二种镰刀菌的形态学特征已总结，代表性结构如图5和图6所示。所有分离株在PDA上均生长迅速，表现出多样的色素沉着和从稀疏绒毛状到致密絮状的气生菌丝质地。菌落特征总体上与文献中各自物种的描述一致。例如，F. acuminatum和F. flocciferum的分离株形成致密的粉红色菌落，带有玫瑰色素，而F. clavum和F. compactum则显示致密的絮状生长并产生黄色至褐色调。相比之下，F. oxysporum和F. proliferatum菌落呈绒毛状，带有紫罗兰色素。在显微镜下，除F. verticillioides外，所有分离株均产生典型的镰刀菌型大分生孢子，其孢子呈镰刀形至纺锤形，透明，分隔数可变（1-7个隔膜）。此外，大多数物种（不包括F. ipomoeae）也能从单瓶梗或多瓶梗产生卵圆形至肾形的微分生孢子。值得注意的是，F. verticillioides和F. proliferatum产生链状微分生孢子但不产生厚垣孢子，而F. acuminatum、F. mucidum和F. compactum等物种则产生丰富且具有诊断意义的厚垣孢子。在大多数物种中观察到孢子座结构，但F. flocciferum和F. mucidum缺乏此结构。详细的物种间区分特征已总结。形态学观察结果与分子鉴定一致，并支持镰刀菌物种的界定。
3.4. 致病力测试
从12种镰刀菌中选择了代表性分离株进行致病力测定。当接种后不久，在羊肚菌子实体的接种点附近出现明显的褐色坏死病斑，导致组织损伤时，认为该分离株具有毒力。接种后1至2天内未观察到明显的病害症状。接种后4天，对照子实体未显示任何症状。相比之下，所有12个测试菌株均在羊肚菌子实体的接种点周围诱发了明显的褐色坏死病斑，平均直径在2.42 ± 0.29 mm至4.75 ± 0.25 mm之间。这表明所有鉴定出的镰刀菌物种对羊肚菌子实体均具有毒力。所有接种的菌株均成功地从有症状的组织中重新分离出来，并通过形态学和分子方法确认了它们的身份。从对照组中未回收到任何真菌。这些结果满足了柯赫氏法则，并证实了所有测试的镰刀菌物种对M. sextelata的致病性。
4. 讨论
丛赤壳科的许多成员已知可感染真菌子实体，包括Dialonectria和Neonectria属的物种。同样属于丛赤壳科的镰刀菌属是一个庞大且生态多样的属，包含腐生菌、内生菌或能够感染多种食用菌和植物寄主的病原菌。Fusarium incarnatum是首个被报道感染羊肚菌的物种，随后F. nematophilum被确认为羊肚菌白霉病的致病菌。其他镰刀菌物种是已知的食用菌病原菌：F. moniliforme引起平菇枯萎病，F. solani导致双孢蘑菇枯萎病和产量损失，F. chlamydosporum是导致黑木耳白毛病的病原。此外，镰刀菌物种是谷物和其他作物，特别是小麦、玉米和大豆的最重要病原菌之一，对现代农业生产构成重大制约。最近的研究进一步表明，一些镰刀菌物种具有昆虫病原潜力，突出了该属广泛的致病谱。
随着羊肚菌栽培的迅速扩展，由镰刀菌和其他病原菌引起的真菌病害日益成为生产者关注的问题。镰刀菌物种在自然界中分布广泛；然而，基于目前的研究，只有F. incarnatum和F. nematophilum被确定为羊肚菌子实体的病原菌，而其他镰刀菌物种在白霉病中的作用仍不清楚。为了填补这一知识空白，我们从832个患病的羊肚菌子实体中分离出120株镰刀菌菌株，并鉴定了与栽培羊肚菌白霉病相关的十二种镰刀菌物种。本研究首次证明这十二种镰刀菌物种对栽培羊肚菌具有致病性。
在鉴定的十二种致病物种中，只有F. clavum、F. compactum和F. ipomoeae与先前报道的F. incarnatum和F. nematophilum同属于F. incarnatum-equiseti物种复合体。其余九个物种分别被归入F. fujikuroi物种复合体、F. oxysporum物种复合体、F. solani物种复合体和F. tricinctum物种复合体。与先前主要关注FieSC的研究不同，本研究表明，来自FieSC以外的多个物种复合体的镰刀菌也能引起羊肚菌白霉病，从而扩大了该病害已知的病原学多样性。
形态学比较进一步支持了本研究中鉴定的镰刀菌物种与先前报道的羊肚菌病原菌之间的区别。在Guo等人的研究中，F. incarnatum的菌落被描述为白色至棕色，具有细长、渐尖的大分生孢子，这些特征与F. clavum、F. compactum和F. ipomoeae部分相似。然而，据报道F. incarnatum会产生明显的霉味，而本研究中F. clavum、F. compactum或F. ipomoeae未观察到明显气味。此外，F. ipomoeae不产生小分生孢子，这进一步将其与F. incarnatum区分开来。在先前关于F. nematophilum引起M. sextelata菌柄腐烂病的研究中，该物种表现出与Pseudodiploospora longispora相似的菌落特征，包括边缘规则、具有明显同心环的白色菌落。相比之下，本研究中获得的镰刀菌分离株产生浅玫瑰色、紫色或褐色色素，且均未形成同心环，证实它们与先前报道的羊肚菌病原菌不同。值得注意的是，F. proliferatum和F. verticillioides形成特征性的微生子链，而F. mucidum产生短而粗壮的大分生孢子。此外，F. avenaceum、F. subglutinans和F. verticillioides不产生厚垣孢子。这些形态学特征清楚地将本研究中鉴定的物种与F. incarnatum和F. nematophilum区分开来。
F. verticillioides（一种众所周知的玉米和其他谷物病原菌）的频繁分离表明，某些镰刀菌物种具有很强的生态适应性，使它们能够定殖包括羊肚菌在内的多种寄主。尽管羊肚菌白霉病的具体机制尚不清楚，且缺乏有效的控制策略，但本研究结果凸显了在羊肚菌栽培体系中实施严格的病害预防、早期检测和综合管理的重要性。野外调查表明，白霉病的发生与出菇阶段的高温高湿密切相关。此外，羊肚菌生产中通常大量使用含有小麦和其他植物性材料的菌种和营养袋。这些营养袋通常由农民在相对简陋的条件下制备，材料选择不当且灭菌不充分。一旦谷物发霉或变质，它们可能成为病原真菌的储存库，被引入栽培土壤，并最终导致白霉病爆发。
为降低白霉病的发生率，建议采取多项措施，包括使用高质量的小麦籽粒和经过彻底灭菌的植物材料、保持清洁的生产环境、定期监测土壤和水源中的病原菌水平，以及优化栽培系统以实现对温湿度的有效控制。当观察到白霉病症状时，应优先收集病害早期阶段表现出典型症状的子实体样本，以提高病原菌分离和鉴定的成功率。
总而言之，本研究表明，来自不同物种复合体的多种镰刀菌可引起羊肚菌白霉病，这与Pseudodiploospora、Clonostachys和Paecilomyces等其他已知病原菌一起，增加了病害管理的巨大复杂性。形态学特征和多基因系统发育分析的结合使用，为准确的病原菌鉴定提供了一个稳健的框架，并将有助于制定有效的羊肚菌栽培白霉病管理策略。未来的研究将侧重于阐明所分离菌株的生物学特性，并基于这些发现探索有针对性的预防和控制技术。
5. 结论
本研究揭示了中国栽培羊肚菌白霉病相关的镰刀菌物种多样性，并阐明了它们的致病作用。共鉴定出跨越五个主要镰刀菌物种复合体的十二个物种，并且所有这些物种都对羊肚菌子实体表现出毒力。这些发现扩展了我们对影响羊肚菌的病原菌的认识，并强调了需要有效的诊断和综合管理来减少羊肚菌栽培中的病害影响。未来的研究应探索环境因素和农业实践如何影响这些病原菌的传播和严重程度，以支持羊肚菌的可持续生产。
