《Journal of Fungi》：Development of a CRISPR/Cas9 Genome Editing System in Dikaryotic Ganoderma lucidum for Targeting Key CYP450 Gene Involved in Triterpenoid Synthesis
Beibei Dong,
Yi Tan,
Gen Zou,
Na Feng,
Linmeng Tang,
Jie Feng,
Yawen Zhang,
Chuanhong Tang and
Jingsong Zhang
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本研究通过对中国16个省份22个栽培基地的832个发病羊肚菌子囊果进行系统调查，分离鉴定出120株镰刀菌(Fusarium)。通过形态学和多基因系统发育分析，最终确认了12个具有致病性的镰刀菌种类，其中轮枝镰刀菌(F. verticillioides)最为常见。研究首次全面揭示了这些镰刀菌种类是中国栽培羊肚菌(Morchella sextelata)白色霉菌病(White Mold Disease, WMD)的致病因子，为制定靶向监测与管理策略提供了关键见解，对保障羊肚菌产业的可持续发展具有重要意义。
1. 引言
羊肚菌(Morchella spp.)是一种属于盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)的高价值食用子囊菌，以其独特的风味、营养价值和药用特性而闻名。自2012年中国开始大田栽培以来，羊肚菌产业迅速扩张，但同时也面临着真菌病害的严峻挑战，其中白色霉菌病(White Mold Disease, WMD)是制约其生产的最具破坏性的病害之一。以往的研究已鉴定出包括假双孢菌(Pseudodiploospora longispora)和菌寄生菌(Clonostachys solani)在内的多种病原菌，但关于镰刀菌(Fusarium)在WMD中的多样性和作用仍知之甚少。为填补这一知识空白，本研究聚焦于中国主要羊肚菌产区，旨在系统分离和鉴定与WMD相关的镰刀菌物种，评估其致病性，为后续制定针对性的防控策略提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 田间调查与取样
在2023年至2025年间，研究团队对中国16个羊肚菌主产省份的22个栽培基地进行了WMD病害调查。从具有典型WMD症状（如图1B所示）的子囊果上共采集了832个样本，用于后续的病原菌分离。
2.2. 真菌分离与培养
采用孢子悬浮液法和组织分离法相结合的方式从发病组织中进行真菌分离。纯化后的菌株保藏于长春大学真菌菌种保藏中心(CCUCC)。
2.3. 形态学鉴定
在PDA培养基上培养7天后，评估菌落形态、色素和生长速率等宏观特征。利用光学显微镜观察分生孢子、厚垣孢子等微观形态特征，并进行测量和拍照记录。
2.4. DNA提取、PCR扩增与测序
提取各分离物的基因组DNA，并对四个基因位点进行PCR扩增和测序，包括内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)、钙调蛋白(calmodulin, CaM)、翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-alpha, tef1)和RNA聚合酶II第二亚基(second largest subunit of RNA polymerase II, rpb2)。
2.5. 系统发育分析
首先基于ITS序列进行初步BLAST比对。随后，选取代表性菌株，利用ITS、tef1、CaM和rpb2基因的串联序列数据集，构建最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯推断法(Bayesian Inference, BI)系统发育树，以进行精确的物种鉴定。
2.6. 致病性测定
依据科赫氏法则(Koch's postulates)，从鉴定出的12个镰刀菌物种中各选取一个代表性菌株，将其孢子悬浮液接种到健康的羊肚菌(M. sextelata)子囊果菌柄表面，以无菌水作为对照。接种后置于人工气候室中培养，每日观察症状发展，并于接种后4天测量病斑平均直径。随后从发病组织中重新分离病原菌，并通过形态学和分子方法验证其身份，以确认其致病性。
2.7. 数据分析
对致病性试验数据（如病斑大小）进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并使用Duncan多重比较检验在p<0.05水平上分析不同处理间的显著性差异。
3. 结果
3.1. 症状描述与调查结果
田间症状表现为密集、白色、绒毛状的菌丝过度生长，子囊果早衰、腐烂和坏死（如图1B所示）。调查和分子鉴定结果显示，镰刀菌的种类和分离频率存在地域差异，中国北方和华中地区的省份（如黑龙江、陕西、河北）表现出更高的物种丰富度和分离频率。
3.2. 分子鉴定
基于形态学特征对120株分离物进行初步分组后，选取了27株代表性菌株进行多基因系统发育分析。构建的ITS-tef1-rpb2和CaM-tef1-rpb2串联系统发育树（图3、图4）将分离物清晰地划分为12个不同的镰刀菌物种，分别为：尖孢镰刀菌(F. acuminatum)、燕麦镰刀菌(F. avenaceum)、棒状镰刀菌(F. clavum)、紧密镰刀菌(F. compactum)、镰状镰刀菌(F. falciforme)、絮状镰刀菌(F. flocciferum)、甘薯镰刀菌(F. ipomoeae)、黏滑镰刀菌(F. mucidum)、尖孢镰刀菌复合种(F. oxysporum)、增殖镰刀菌(F. proliferatum)、胶孢镰刀菌(F. subglutinans)和轮枝镰刀菌(F. verticillioides)。这些物种分别归属于五个主要的镰刀菌物种复合体，包括三线镰刀菌复合体(F. tricinctum species complex, FtSC)、尖孢镰刀菌复合体(F. oxysporum species complex, FoCS)、藤仓镰刀菌复合体(F. fujikuroi species complex, FfSC)、腐皮镰刀菌复合体(F. solani species complex, FsSC)以及 incarnatum-equiseti复合体(F. incarnatum-equiseti species complex, FieSC)。其中，轮枝镰刀菌(F. verticillioides)是最常见的物种，占所有分离株的22.5%。
70%)和贝叶斯后验概率(BI-PP > 0.9)(BI-PP/ML-BS)。">
3.3. 形态学特征
所有分离株在PDA培养基上均生长迅速，菌落色素和菌丝质地多样。典型的镰刀菌大分生孢子呈镰刀形至纺锤形，透明，具1-7个隔膜。大多数物种（除F. ipomoeae外）都能从单瓶梗或多瓶梗中产生卵形至肾形的微小分生孢子。轮枝镰刀菌(F. verticillioides)和增殖镰刀菌(F. proliferatum)可产生链状微小分生孢子但不产生厚垣孢子，而尖孢镰刀菌(F. acuminatum)、黏滑镰刀菌(F. mucidum)和紧密镰刀菌(F. compactum)等物种则产生丰富且具有诊断意义的厚垣孢子。分生孢子座结构在大多数物种中存在，但在絮状镰刀菌(F. flocciferum)和黏滑镰刀菌(F. mucidum)中未见。
3.4. 致病性测试
选取12个镰刀菌物种的代表性菌株进行致病性测定。接种96小时后，对照组子囊果无症状（图7A），而所有12个测试菌株均在羊肚菌子囊果接种点周围诱导产生了明显的褐色坏死病斑，平均病斑直径在2.42 ± 0.29 mm至4.75 ± 0.25 mm之间（图7B-M，图8）。从发病组织中均成功重新分离到了相应的镰刀菌，并通过形态学和分子方法验证了其身份，而对照组未分离到任何真菌。这完全符合科赫氏法则，证实了所有鉴定出的镰刀菌物种对六妹羊肚菌(M. sextelata)子囊果均具有致病性。
4. 讨论
镰刀菌属是一个种类繁多、生态多样的属，包含腐生菌、内生菌和病原菌，可侵染多种食用菌和植物宿主。在羊肚菌栽培中，此前仅报道了F. incarnatum和F. nematophilum是羊肚菌的病原菌。本研究首次系统性地鉴定出12个镰刀菌物种可引起羊肚菌WMD，极大地扩展了对该病害病原菌多样性的认知。其中，仅F. clavum、F. compactum和F. ipomoeae属于之前报道过的F. incarnatum–equiseti复合体(FieSC)，而其余9个物种则分属于藤仓镰刀菌复合体(FfSC)、尖孢镰刀菌复合体(FoSC)、腐皮镰刀菌复合体(FsSC)和三线镰刀菌复合体(FtSC)。这表明，除FieSC外，来自多个物种复合体的镰刀菌也能引起羊肚菌WMD，增加了病害的复杂性。
形态学比较进一步支持了本研究中鉴定的镰刀菌物种与以往报道的羊肚菌病原菌之间的区别。例如，轮枝镰刀菌(F. verticillioides)和增殖镰刀菌(F. proliferatum)可形成特征性的链状微小分生孢子，而F. avenaceum、F. subglutinans和F. verticillioides不产生厚垣孢子，这些特征与已报道的F. incarnatum和F. nematophilum明显不同。
轮枝镰刀菌(F. verticillioides)作为一种众所周知的玉米和其他谷物病原菌，在本次研究中频繁被分离到，这表明某些镰刀菌物种具有很强的生态适应性，能够定殖包括羊肚菌在内的多种宿主。田间调查表明，WMD的发生与出菇期的高温高湿环境密切相关。此外，羊肚菌生产过程中大量使用含有小麦等植物性原料的菌种袋和营养袋，如果这些材料选择不当或灭菌不彻底，一旦谷物霉变，就可能成为病原真菌的储存库，被引入栽培土壤，最终导致WMD暴发。
为降低WMD的发生率，建议采取包括使用高质量且经过彻底灭菌的小麦籽粒和植物材料、保持清洁的生产环境、定期监测土壤和水源中的病原菌水平、以及优化栽培系统以有效控制温湿度等措施。当观察到WMD症状时，应优先采集病害早期阶段的典型症状子囊果样本，以提高病原菌分离和鉴定的成功率。
总体而言，本研究揭示了多种来自不同物种复合体的镰刀菌均可引起羊肚菌WMD，这与已知的其他病原菌如假双孢菌(Pseudodiploospora)、菌寄生菌(Clonostachys)和拟青霉(Paecilomyces)一起，增加了病害管理的复杂性。结合形态学特征和多基因系统发育分析，为准确鉴定病原菌提供了一个强有力的框架，并将促进制定有效的羊肚菌WMD管理策略。
5. 结论
本研究揭示了中国栽培羊肚菌WMD相关的镰刀菌物种具有丰富的多样性，并明确了它们的致病作用。共鉴定出属于五个主要镰刀菌物种复合体的12个物种，且所有这些物种均对羊肚菌子囊果表现出致病性。这些发现扩展了我们对影响羊肚菌病原菌的认识，并突显了在羊肚菌栽培中实施有效诊断和综合管理以减少病害影响的必要性。未来的研究应探索环境和农事操作如何影响这些病原菌的传播和严重程度，以支持羊肚菌的可持续生产。
