《Epigenomes》：CpG Methylation of Protein Prenyltransferase Genes FNTA, FNTB, PGGT1B and RABGGTA in Cancer Cell Lines
Dominik Jung,
Daniel Diehl,
Anna Hagemann and
Hagen Sjard Bachmann
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本研究深入探讨了蛋白异戊烯基转移酶（PTase）基因在癌症中的表观遗传调控。通过对FNTA、FNTB、PGGT1B和RABGGTA四个基因启动子区CpG岛进行焦磷酸测序分析，研究发现，尽管在整体上良性细胞与癌细胞之间PTase基因的甲基化水平未见普遍差异，但在多个特定癌细胞系（如肾癌细胞Caki-1）中观察到显著差异。尤为重要的是，PGGT1B基因的DNA甲基化水平与其mRNA表达呈显著负相关。这提示PGGT1B的表达在肾癌中可能受DNA甲基化调控，鉴于PGGT1B是肾透明细胞癌的预后标志物，此发现为探究癌症中PTase表达失调的机制提供了新的表观遗传学视角。
1. 引言
蛋白异戊烯基转移酶（Protein Prenyltransferases, PTases）是一类保守的异二聚体酶，包括法尼基转移酶（Farnesyltransferase, FTase）以及I型和II型香叶基香叶基转移酶（Geranylgeranyltransferase type I and II, GGTase I and GGTase II）。它们利用甲羟戊酸途径的中间产物法尼基二磷酸（Farnesyldiphosphate, FPP）或香叶基香叶基二磷酸（Geranylgeranyldiphosphate, GGPP），对数百种蛋白质（包括许多由原癌基因编码的蛋白，如Ras）进行翻译后修饰。这种被称为蛋白质异戊烯化（Protein Prenylation）的过程对于这些蛋白质的正确定位和功能至关重要。PTase的异常表达已在多种癌症中被频繁观察到，例如卵巢癌、皮肤癌、胶质瘤和肝癌。然而，导致癌症中PTase表达差异的原因在很大程度上仍是未知的。
DNA甲基化，特别是发生在基因调控区CpG岛上的甲基化，是调节基因表达的一种主要表观遗传机制，在癌症中经常发生改变。对于GGPP合酶（GGPPS）基因，已有研究证实其启动子的差异甲基化与基因表达改变、蛋白质异戊烯化异常及疾病进展相关。因此，本研究假设，人类PTase基因的启动子可能也含有在癌细胞中表现出独特甲基化模式的CpG岛，从而改变PTase在癌症中的表达。为此，研究人员考察了FTase（FNTA和FNTB）、GGTase I（FNTA和PGGT1B）和GGTase II（RABGGTA和RABGGTB）基因启动子区的CpG岛。
2. 结果
2.1. CpG岛的特征
研究发现，FNTA、FNTB、PGGT1B和RABGGTA（而非RABGGTB）的转录起始位点（Transcription Start Site, TSS）被CpG岛覆盖。通过亚硫酸氢盐测序PCR（Bisulfite Sequencing PCR, BSP），在每个基因的CpG岛内扩增出特定的目标区域（Region of Interest, ROI），产物经琼脂糖凝胶电泳验证为单一特异性条带，符合后续焦磷酸测序的要求。
2.2. DNA甲基化分析
所有被分析的PTase基因和细胞系中的平均甲基化水平在1.9 ± 0.9% 到 16.0 ± 5.4%之间。将良性样本（全血、外周血单个核细胞PBMCs和HEK293细胞）组与癌细胞系组进行比较时，未发现DNA甲基化存在显著差异。然而，当将每个癌细胞系分别与三个非恶性对照细胞进行比较时，发现了许多癌细胞系在每个PTase基因的甲基化上存在轻微但具有统计学意义的差异。其中，对于FNTA、RABGGTA和PGGT1B，甚至有多个癌细胞系表现出与所有三个良性对照均显著不同的DNA甲基化。特别是在肾透明细胞癌细胞系Caki-1和神经母细胞瘤细胞系Kelly中，FNTA的甲基化一致性地高于良性对照。
2.3. mRNA表达与DNA甲基化的相关性
通过定量PCR（qPCR）和绝对定量技术，研究人员测量了部分细胞系中PTase基因的mRNA表达水平。结果显示，全血样本中FNTA、FNTB和RABGGTA的表达量比其他样本高出一个数量级。通过计算DNA平均甲基化水平与转录本数量之间的皮尔逊相关系数（Pearson Correlation Coefficient, PCC），发现只有PGGT1B基因的DNA甲基化与其mRNA表达呈显著的负相关（PCC = -0.75; p = 0.005）。即使在排除作为异常值的全血样本后，这种负相关依然存在（PCC = -0.73; p = 0.011）。具体而言，在肾癌细胞系Caki-1中，PGGT1B的DNA甲基化低于HEK293细胞，而其mRNA表达则更高，这与公共表达数据库的数据一致。
3. 讨论
这项探索性研究的结果支持了PTase在癌症中的差异表达可能受其基因DNA差异甲基化影响的假说。尽管在整体组间比较中未发现显著差异，但对单个细胞系的精细分析揭示了癌细胞与特定非恶性对照之间存在显著但幅度较小的甲基化差异。其中，PGGT1B甲基化与表达的显著负相关是最明确的发现，尤其是在肾细胞癌背景下。公开数据表明PGGT1B表达是肾透明细胞癌的一个已验证的预后因素，因此本研究发现的表观遗传调控机制可能对未来肾癌的管理具有意义。
研究存在一些局限性。首先，使用的细胞系模型（包括HEK293）和混合细胞样本（全血、PBMCs）可能无法完全代表体内原代组织的生理或病理状态。其次，焦磷酸测序技术只分析了每个CpG岛的一小部分区域。此外，DNA甲基化仅是基因表达的调控层之一，FNTA、FNTB和RABGGTA缺乏甲基化与表达的相关性，可能反映了其他调控机制（如转录因子水平、组蛋白修饰或非编码RNA）的影响。未来的研究需要在匹配的原代肿瘤组织中进行验证，并采用长读长测序等技术更全面地考察PTase基因的甲基化状态，同时需在功能层面上验证DNA甲基化、PTase表达、蛋白异戊烯化水平与癌症进展之间的因果关系。
4. 材料与方法
4.1. CpG岛识别与引物设计
使用NCBI基因组数据查看器分析PTase基因启动子区的CpG岛。利用PyroMark Assay Design软件设计用于亚硫酸氢盐转化后PCR的引物。
4.2. 细胞培养
使用了19种不同来源的人类癌细胞系以及HEK293细胞。所有细胞均在标准条件下（37°C, 5% CO2）使用添加了10%胎牛血清和抗生素的相应培养基进行培养。
4.3. DNA提取与亚硫酸氢盐处理
使用试剂盒从细胞沉淀或商业获取的全血/PBMC样本中提取基因组DNA。使用EpiTect Bisulfite Kit对DNA进行亚硫酸氢盐转化。使用高度甲基化和低甲基化的对照DNA作为阳性和阴性对照。
4.4. 亚硫酸氢盐测序PCR与焦磷酸测序
对转化后的DNA进行BSP扩增目标区域。PCR产物纯化后，在PyroMark Q24仪器上进行焦磷酸测序。每个样本的每个目标区域至少进行三次重复测序。
4.5. RNA提取与cDNA合成
使用试剂盒提取总RNA，并用DNase I处理以去除基因组DNA污染。使用逆转录试剂盒将RNA合成cDNA。
4.6. 质粒制备与线性化
使用包含目标基因编码序列的质粒，经限制性内切酶线性化并纯化后，作为qPCR绝对定量的标准品。
4.7. 逆转录定量PCR
使用SYBR Green染料在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。利用线性化质粒DNA的系列稀释液建立标准曲线，从而绝对定量样本中目标基因的转录本拷贝数。所有实验条件均包含三个生物学重复，每个重复设两个技术重复。
4.8. 统计分析
使用Python进行统计分析。采用t检验比较两组间甲基化差异，采用方差分析（ANOVA）及Dunnett's事后检验比较多组间差异。使用皮尔逊相关系数评估DNA甲基化与基因表达的相关性。p < 0.05被认为具有统计学显著性。
5. 结论
对19个癌细胞系DNA甲基化的靶向分析显示，在PTase基因FNTA、FNTB、PGGT1B和RABGGTA启动子相关的CpG岛甲基化上，良性细胞与癌细胞系之间没有普遍差异。然而，观察到多个特定癌细胞系与某些对照细胞之间存在显著差异，其中最显著的是HEK293细胞与肾癌细胞系Caki-1之间在FNTA、RABGGTA和PGGT1B甲基化上的差异。
在所有分析的良性细胞和恶性细胞中，观察到PGGT1B的DNA甲基化与其mRNA表达总体上呈负相关。具体来说，Caki-1细胞中PGGT1B的甲基化低于HEK293细胞，而其mRNA表达更高。这一发现证实了关于这些细胞系mRNA表达的公开数据，并增加了导致这种差异表达的可能原因的信息。
考虑到DNA甲基化的差异虽然显著但相对较小，通过DNA甲基化对癌细胞系中PTase表达进行普遍的、具有生物学意义的调节似乎不太可能。尽管如此，研究描述了肾良性细胞与恶性细胞之间PGGT1B在DNA甲基化和表达上的明显区别，这值得在后续研究中，对来自肾脏的良性和恶性原代组织中PGGT1B的表现遗传调控进行更集中的研究。
总之，研究结果提示了在肾癌背景下通过DNA甲基化表现遗传调控PGGT1B表达的可能性，因此有必要在原代组织，特别是肾透明细胞癌中开展进一步研究。
