在纳米多孔钛表面上涂覆ROS催化铜层，可实现具有抗菌和促进骨生成双重功能的植入物

《Applied Surface Science》：Surface-ROS-catalytic copper on nanoporous titanium enables antibacterial and osteogenic dual-function implants

纳米多孔钛氧化物支架调控铜氧化物纳米结构实现高效抗菌与骨整合协同作用。通过碱性热处理获得的三维纳米多孔TiO?网络，将表面整合的铜氧化物纳米颗粒（5-10 nm）束缚于纳米限域中，抑制Cu2+离子的系统性释放（0.12 μg/L·cm?2），转而通过Ti-OH活性位点高效催化H?O?转化为ROS，在12小时内对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实现>99.9%的杀菌率。该纳米结构不仅抑制了Cu2+的细胞毒性，还通过仿生微纳拓扑、超亲水性及低离子释放维持了>80%的成骨细胞相容性，突破传统抗菌涂层与骨整合的效能平衡难题。

　　

黄海东|朱燕|沈涛|董明荣|刘金坤

昆明理工大学材料科学与技术学院，中国昆明650093

摘要

钛植入物的临床成功常常受到术后感染和骨整合不足的影响。一个根本性的挑战在于如何将强大的抗菌作用与细胞毒性离子的释放分离开来。在这里，我们证明了碱热处理得到的纳米多孔TiO₂支架（50–200纳米）能够从根本上改变表面整合铜的抗菌机制：传统的平面Cu涂层钛依赖高浓度的Cu²⁺来杀灭细菌，而纳米限制的CuO（5–10纳米）在多孔网络中通过表面局部产生的活性氧（ROS）驱动的途径发挥作用，在12小时内能够消灭99.9%以上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，同时Cu²⁺的释放量减少了8倍（0.12微克/升·厘米²对比约1.0微克/升·厘米²）。从机制上讲，纳米孔延长了Cu²⁺的扩散路径，并提供了Ti–OH位点以保留离子，同时促进了H₂O₂向·OH的转化。重要的是，这种设计不仅保留了而且增强了成骨能力：仿生地形、超亲水性以及微量Cu²⁺的释放协同促进了羟基磷灰石的成核和前成骨细胞的相容性（RGR > 80%）。我们的工作为抗菌植入物设计树立了一个新的范式：纳米结构可以重新编程基于金属的杀菌机制，实现抗菌性和骨再生的同时提升，而无需做出妥协。

引言

钛及其合金因其机械强度、耐腐蚀性和生物相容性而被广泛用于骨科和牙科植入物[1]，[2]。然而，临床成功经常受到两个持续存在的挑战的阻碍：早期骨整合不足以及由于细菌定植和生物膜形成导致的术后感染风险[3]，[4]，[5]，[6]。术后感染大约影响了2–5%的病例，常常导致需要再次手术，增加了医疗负担。因此，迫切需要设计出能够同时加速骨整合和预防感染的植入物表面——这一任务因增强抗菌功能可能会增加细胞毒性或影响生物活性而变得复杂[7]。

碱热处理已成为钛表面生物活化的主流方法[8]，[9]，[10]，[11]。这一过程会产生一个亲水的三维纳米多孔钛酸盐层，经过热处理后稳定为纳米结构的氧化物。所得表面具有高粗糙度、丰富的羟基团和负的ζ电位，这些都是促进模拟体液（SBF）中羟基磷灰石快速成核的关键因素，并有利于体内的骨整合[9]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]。尽管有这些优势，碱热处理后的表面本质上缺乏抗菌性能，仍然容易受到细菌定植的影响，这最终可能损害植入物的寿命和患者的结果[4]，[5]，[6]。

已经探索了多种方法，如抗生素涂层和有机抗菌层来解决这一问题，但它们的临床应用受到耐药细菌的出现、效力迅速丧失以及与先进纳米结构不兼容等问题限制[6]，[18]，[19]，[20]。在这种情况下，将抗菌金属元素（特别是银、铜和锌）可控地结合到碱热处理的纳米多孔结构上引起了极大的兴趣，因为这有望实现持久、广谱的抗菌效果，同时保持骨整合能力[21]，[22]，[23]。其中，铜因其强大的抗菌活性、较低的细菌耐药性风险、促进血管生成的效果以及相对安全的生物学特性而脱颖而出[24]，[25]。从机制上讲，铜通过三种主要途径发挥抗菌作用：直接释放有毒的Cu²⁺离子、催化生成活性氧（ROS）导致细菌氧化损伤，以及与颗粒大小、形态和表面状态相关的物理干扰[26]，[27]，[28]，[29]，[30]。关键在于，在不导致过量Cu²⁺泄漏（对宿主细胞有毒）的情况下实现强大的抗菌效果是一个尚未解决的挑战。

铜的整合方法有多种，包括微弧氧化、阳极氧化、电化学和水热处理[31]，[32]，[33]，[34]，[35]。然而，这些技术中的许多可能会损坏或掩盖碱热处理形成的精细纳米多孔结构。磁控溅射作为一种优越的解决方案，提供了原子级别的厚度控制、高工艺均匀性，并对现有表面纳米结构的影响最小[36]，[37]。该过程能够将微量铜精确地输送到生物活性多孔支架上，特别适合于多功能植入物的应用。此外，沉积后的退火可以调节氧化状态和表面分散性，进一步优化生物响应。

尽管最近取得了进展，但仍存在一些关键的知识空白：(i) 如何有效地将铜与碱热处理后的表面结合，以实现抗菌和成骨功能之间的真正协同作用，同时保护细胞相容性尚未完全解决；(ii) 铜的氧化状态、ROS生成和纳米限制在调控抗菌和成骨机制中的相对作用尚不清楚；(iii) 如何在不使纳米级铜氧化物粗化或失去功能的情况下稳定它们，这方面的研究还不够充分。

在这里，我们假设碱热处理得到的纳米多孔结构不仅仅是稳定了CuO纳米颗粒，它还积极重新编程了界面抗菌机制。具体来说：

(i)

纳米限制不仅限制了颗粒的粗化，还改变了Cu²⁺的传输动态，抑制了离子的系统性泄漏；

(ii)

由此产生的超细CuO与富含羟基的孔壁相结合，形成了一个以ROS生成为主的催化活性界面，而不是离子溶解作为主要的杀菌途径；

(iii)

这种双重控制减少了细胞毒性，同时保持了生物活性地形，实现了高效抗菌作用和增强的成骨作用，克服了多功能植入物设计中的传统权衡。

这些假设通过全面的结构和化学表征、定量抗菌和细胞相容性测试以及体外成骨矿化研究得到了验证。我们的发现为设计具有高水平抗菌活性和骨整合能力的钛植入物表面提供了一条可扩展的途径，为下一代多功能骨科植入物的开发提供了一种全新的策略。

材料与仪器

医用级钛合金基底（Ti-6Al-4V，14.8 × 16.8 × 0.7毫米³）来自Oakes Metal公司。高纯度铜靶材（Φ50.8毫米，99.99%）购自中诺电子材料有限公司。氢氧化钠（NaOH，分析级）、无水乙醇（C₂H₅OH，99.7%）、丙酮（CH₃COCH₃，分析级）和去离子水（18.2 MΩ·cm，自制）用于样品制备。高纯度氩气（Ar，99.999%）和氮气（N₂，99.999%）由...

表面形态与化学

图2展示了在不同条件下处理的钛合金表面的扫描电子显微镜（SEM）图像。首先可以看出，在碱热处理前后，铜沉积物上没有明显的表面形态特征（图2a和b）。然而，经过热处理后，铜颗粒变得清晰可见（图2c及其放大视图2c'）。如图2d所示，碱热处理产生了一个均匀的三维（3D）纳米多孔网络结构。

碱热处理通过纳米限制和表面化学修饰调节铜颗粒的形态

广泛报道碱热处理可以在材料表面生成纳米多孔网络[44]，尽管处理参数（NaOH浓度、处理时间和温度）的不同可以产生不同的纳米结构，包括纳米凸起、片状多孔结构[45]、纳米针阵列和三维纳米支架[46]，[47]。在本研究中，SEM和AFM表征显示碱热处理产生了三维片状纳米多孔结构

结论

总之，我们证明了铜功能化钛植入物的抗菌机制并非铜本身固有的，而是由底层的纳米结构决定的。通过设计碱热处理的纳米多孔支架，我们成功地将表面CuO的杀菌作用从细胞毒性离子释放转变为局部ROS催化的途径。这一策略性转变实现了三个关键目标的同时实现：(i) 快速、广谱的...

CRediT作者贡献声明

黄海东：撰写——原始草稿，验证，研究。朱燕：验证，监督，资源获取，资金筹集。沈涛：资源获取，资金筹集，正式分析，数据管理。董明荣：验证，项目管理，方法学，数据管理。刘金坤：撰写——审稿与编辑，监督，资源获取，项目管理，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：12264022）、云南省青年人才一万计划（朱燕、沈涛，社会发展编号：201873）以及云南省教育厅科学研究基金（项目编号：2023J0120）的支持。