甲状腺激素在橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）早期性腺分化过程中增强了雄激素诱导的性别反转作用

《Aquaculture》：Thyroid hormone potentiates androgen-induced sex reversal during early gonadal differentiation in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides

本研究探讨三碘甲状腺原氨酸（T3）是否能增强甲基睾酮（MT）诱导橙斑胡椒鲈早期卵巢分化阶段的性别逆转。通过56天不同处理组的喂养及组织学、激素和转录组分析，发现MT联合T3能完全消除雌性生殖细胞，而单独MT仅部分逆转。T3协同MT上调雄性相关基因dmrt1、cyp11b，抑制雌性基因foxl2、cyp19a1a，证实甲状腺信号对雄性诱导的关键作用，为优化鲈鱼雄性亲本生产提供新策略。

　　

罗丽媛|陈川|肖倩|李文|李新怡|邱丽茜|邱重庆|吴金辉|黄景雄|王青|赵慧红

中国华南农业大学海洋科学学院，广州510642

摘要

在原雌性石斑鱼中诱导性别反转通常发生在卵巢分化之后。然而，在早期关键窗口期实现可靠的雄性化仍然具有挑战性。本研究探讨了三碘甲状腺原氨酸（T3）是否能够增强甲基睾酮（MT）诱导的性别反转效应。实验中，将处于卵巢分化早期阶段的鱼分别喂食仅含MT的饲料、MT与甲状腺抑制剂甲巯咪唑（MT + MET）的混合饲料，或MT与T3的混合饲料，持续56天。组织学分析显示，只有MT + T3组在处理后56天时完全消除了雌性生殖细胞，而MT组仍保留有卵原细胞，表现为具有可变性的生殖腺。MT与MET的联合处理未能阻止精子的发生，其生殖腺结构与仅使用MT的组相似。内分泌学检测表明，MT处理显著提高了血清中的T3和T4水平。在MT + T3组中，血清T3水平在处理后14天时短暂下降，但在处理后35天和56天时由于睾丸发育而超过了仅使用MT组的水平。转录组分析显示，类固醇激素生物合成途径相关基因的表达显著增强。进一步的RT-qPCR分析证实，T3协同增强了与雄性相关的基因（dmrt1、cyp11b）的表达，并显著抑制了与雌性相关的基因（foxl2、cyp19a1a）的表达。体外实验表明，这种调节效应随着T3浓度的增加而增强。这些发现表明，甲状腺信号在雄激素诱导的性别反转过程中起着关键协调作用，为优化石斑鱼养殖中的雄性亲本生产提供了有希望的策略。

引言

脊椎动物表现出多种性别系统，包括雌雄异体（不同的性别）、雌雄同体以及单性（Pla等人，2022年）。许多石斑鱼所表现出的原雌性雌雄同体现象为研究性别决定和分化的可塑性提供了独特的模型。在鱼类中，具有双潜能的生殖腺的命运最初由性别决定决定，随后分化为卵巢或睾丸。这些过程受到遗传和环境因素复杂相互作用的影响（Baroiller等人，2009年；Heule等人，2014年；Stelkens和Wedekind，2010年）。在环境性别决定（ESD）的物种中，温度等信号通过应激反应途径转化为生理信号，最终通过激素、基因和细胞之间的相互作用影响性别（Shen和Wang，2018年）。重要的是，激素被认为是将环境信息转化为生理信号以影响性别比例的主要介质（Navara，2013年）。大量研究证实，在性别决定期间施用外源性激素可以显著影响鱼类的性别分化，突显了激素的关键作用（Nakamura，2010年）。

甲状腺激素（THs）是调控脊椎动物生长、代谢和繁殖的多效调节因子（Blanton和Specker，2007年；Deal和Volkoff，2020年；Tovo-Neto等人，2018年）。除了其系统作用外，THs还与其他内分泌轴存在复杂的相互作用，尤其是性类固醇激素途径（Duarte-Guterman等人，2014年；Sun等人，2016年）。越来越多的证据表明，THs在鱼类物种的生殖腺性别分化中起着决定性作用（Casta?eda-Cortés等人，2023年；Rodrigues等人，2021年；Sawatari等人，2007年；Sharma等人，2016年；Yuan等人，2021年）。例如，三碘甲状腺原氨酸（T3）引起的甲状腺功能亢进会导致斑马鱼（Danio rerio）和无尾两栖动物胚胎的性别比例偏向雄性，而抑制THs的合成则会增加雌性的比例（Goleman等人，2002年；Mukhi等人，2007年）。机制研究表明，T3在斑马鱼和稻田鳝（Monopterus albus）等物种中能够下调促进雌性的基因（如cyp19a1a、foxl2），并上调与雄性相关的基因（如amh、sox9a1）（Feng等人，2022年；Sharma等人，2016年）。这些发现表明，THs是类固醇生成途径的强效调节因子，可能影响雄性和雌性发育轨迹的平衡。

橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）是中国和东南亚的主要海水养殖物种，是一种高价值、具有商业重要性的海产品（Zhou等人，2011年）。该物种属于石斑鱼科，属于原雌性雌雄同体（Hastings和Petersen，1986年；Leonard，1993年）。对野生种群的研究表明，E. coioides的自然性别反转过程非常漫长，个体通常需要4-5年才能从雌性分化为功能性雄性（Chen等人，2019年；Qing等人，2017年）。虽然自然条件下一个雄性可以 fertilize 多个雌性，但这种漫长的性别转变潜伏期对水产养殖构成了显著限制。无法在较早年龄获得功能性雄性亲本，阻碍了大规模人工繁殖的稳定亲本建立，严重限制了高质量鱼苗的生产（Ybanez Jr和Gonzales，2023年）。目前，在人工养殖中，通过施用外源性雄激素如甲基睾酮（MT）在卵巢分化后诱导性别反转是一种可行的策略（Bhandari等人，2004年；Yeh等人，2003年）。然而，这种方法通常需要高剂量的激素干预和较长的诱导周期来抵消已建立的雌性生理状态和生殖腺分化（Budd等人，2015年）。相比之下，在生殖腺分化阶段（通常称为“不稳定阶段”）进行干预具有周期短和剂量低的显著优势。在这个阶段，尽管石斑鱼的生殖腺已经经历了卵巢分化（表现为卵原细胞和卵巢腔的存在），但组织仍具有高度的可塑性，对外源性因素更敏感（Budd等人，2015年）。然而，在生殖腺分化阶段，MT处理往往导致石斑鱼的雄性化不完全或短暂，停止处理后个体会恢复为雌性（Carman等人，2023年；Murata等人，2014年；Qing等人，2017年）。

我们假设，在这个早期窗口期难以实现完全雄性化的原因在于雄激素单独作用不足以充分抑制雌性基因的表达。鉴于THs与类固醇激素轴之间的相互作用、关键雌性基因的抑制作用，以及THs与促性腺激素信号之间的协同作用以增强雄激素的产生（Tovo-Neto等人，2018年），我们推测甲状腺激素是雄激素作用的关键增强因子。因此，本研究旨在探讨THs是否能够在E. coioides的生殖腺分化早期阶段促进稳健和稳定的MT诱导雄性化。通过使用甲巯咪唑（MET）抑制内源性THs的合成，并补充外源性T3，我们试图阐明THs影响这一过程的机制，以建立更有效和及时的方法来生产雄性亲本。

实验动物和伦理批准

所有动物实验均按照华南农业大学海洋科学学院制定的《实验室动物护理和使用指南》进行。实验程序获得了华南农业大学动物伦理委员会的批准，并遵守了所有相关的中国法律、法规和伦理标准。实验用的橙斑石斑鱼（180天大；初始体重：107.85 ± 12.13克）来自广东

生殖腺的组织学

对E. coioides各处理组的生殖腺组织切片进行组织学分析，发现了不同的发育轨迹（图1、图2）。实验开始时，所有组的生殖腺都处于卵巢发育的初始阶段，生殖腺中存在大量卵原细胞（图2和补充图S1）。在处理后14天，MT组开始出现核周卵母细胞，而其他组仍保留大量卵原细胞（图1）。到处理后21天，MT组

讨论

本研究表明，在橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）中，三碘甲状腺原氨酸（T3）在生殖腺分化的早期关键窗口期施用时，能够显著增强并促进雄激素诱导的雄性化。尽管甲基睾酮（MT）是性别反转的主要外源性触发因素，但外源性T3的补充显著加速了从卵巢组织向睾丸组织的转变。

结论

总之，我们的发现表明，T3与MT（MT + T3）协同作用，在橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的早期生殖腺分化阶段促进了更明显的雄性组织转变。这种联合处理方案比单独使用MT（通常发生在卵巢分化之后）更早启动了雄性发育程序，表明有可能显著缩短雄性诱导的窗口期。

作者贡献声明

罗丽媛：撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、概念化。陈川：撰写——审稿与编辑、软件使用、资源提供、调查、正式分析、数据管理。肖倩：验证、监督、资源提供、概念化。李文：验证、调查、数据管理。李新怡：方法学、调查。邱丽茜：方法学、调查。邱重庆：调查。吴金辉：监督、资源提供。黄景雄：验证

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：31972768）的资助。