高原原住人群的脑电与肠道菌群反应模式
引言
高海拔环境（>2,500 米）会带来慢性低压缺氧、干燥、极端温度波动和强紫外线辐射，对人体构成严峻的生理挑战。大脑作为高耗氧且对缺氧极度敏感的器官，尤其易受高海拔影响。低地人群急性暴露于高海拔可导致记忆损伤、注意力缺陷、情绪失调和睡眠障碍。然而，以藏族为代表的高原原住人群，尽管终生处于缺氧环境，却表现出显著的神经和认知功能维持能力。这种适应力归因于独特的遗传（如 EPAS1基因变异）和经多代获得的生理适应。然而，慢性缺氧下维持大脑健康的神经生理机制仍未完全阐明。
神经影像学研究为直接观察高原居民独特的大脑适应性变化提供了一些证据。脑电图（EEG）研究报告了高海拔暴露与神经生理变化之间的非线性关系：早期处理阶段认知资源消耗增加，随后通过生理适应逐渐恢复并可能增强。基于移民的研究也报告了枕叶静息态功能连接（FC）的增加，以及执行控制任务期间更高效的大脑网络重组，这可能优化了感知和运动协调。然而，原住民自妊娠期和关键的神经发育期就经历缺氧，并拥有独特的遗传适应，因此基于移民的发现不能直接外推至他们。关于原住高原居民终生神经适应的直接证据仍然稀缺。
肠道微生物组是胃肠道中与宿主共生的微生物群落，是环境压力源与宿主生理过程之间的动态界面。新出现的证据表明，肠道菌群是高海拔环境压力下的关键调节器。高原居民表现出独特的微生物特征，例如厚壁菌门（Firmicutes）更为丰富，其中许多是短链脂肪酸（SCFA）的主要生产者。SCFA在大脑中可以调节神经炎症，帮助维持屏障完整性，并进一步影响突触可塑性和神经递质合成。这些综合效应可能有助于高海拔习服。虽然大脑功能改变和肠道菌群变化在高海拔适应中已被广泛报告，但它们在原住人群中的潜在相互作用仍不清楚。
本研究检验了“终身居住于高海拔环境会引发肠道菌群和大脑活动的协同适应”这一假说。为控制潜在的遗传混杂因素并分离高海拔暴露的效应，研究聚焦于汉族人群。分别对生活在2公里、3公里和4公里海拔的原住人群进行静息态和任务态脑电（EEG）采集，并同时进行其肠道菌群的16S rRNA测序。静息态分析聚焦于功率谱密度（PSD）和功能连接（FC），而任务态分析则检查了视觉oddball（奇偶）任务期间的事件相关电位（ERP）和时频动态。通过相关性分析来检查微生物特征与神经指标之间的关联。本研究旨在调查高海拔引起的肠道菌群变化与神经生理适应之间的联系，并阐明肠-脑相互作用的潜在作用。
材料与方法
受试者 这项横断面研究招募了211名健康、土生土长、在各自海拔地区有连续终身居住史的汉族成年人。参与者按居住海拔分为三组：2公里组（n= 70，平均年龄 34.4 ± 10.1 岁，女43/男27），3公里组（n= 72，平均年龄 36.7 ± 10.2 岁，女33/男39）和4公里组（n= 69，平均年龄 34.9 ± 12.1 岁，女31/男38）。所有参与者视力正常或矫正至正常，均为右利手，无神经或精神疾病史、严重心血管疾病、慢性肺部疾病、糖尿病、高血压或其他系统性疾病史，无吸烟或酗酒史。
神经心理学评估 评估在两位训练有素的心理健康专业人士的直接监督下进行。评估组合包括用于情绪评估的自评焦虑量表（SAS）和自评抑郁量表（SDS），用于睡眠质量评估的匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）和Epworth嗜睡量表（ESS）。加州语言学习测试（CVLT）用于通过五轮包含16个语义分类词的试验、干扰列表指令后的短延迟（5分钟）和长延迟（20分钟）回忆以及最终的再认试验来评估语言学习和记忆。
肠道微生物组分析 神经心理学测试后，参与者立即使用无菌收集试剂盒自行收集新鲜粪便样本。总基因组DNA使用OMEGA土壤DNA试剂盒提取。通过NanoDrop NC2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估提取DNA的数量和质量。使用通用引物338F和806R扩增16S rRNA基因的V3-V4区域，并添加7 bp条形码，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行2×250 bp双端测序。测序后，数据在QIIME 2中处理，通过cutadapt进行解复用和引物修剪。然后使用DADA 2对序列进行质量过滤、去噪、合并和嵌合体过滤，以生成扩增子序列变体（ASV）。使用mafft比对ASV，使用FastTree 2构建系统发育树，并通过在Greengenes2参考数据库上训练的天真贝叶斯分类器进行物种分类分配。
生物信息学和统计分析主要使用QIIME2和R包进行。计算Alpha多样性指数（Chao1、Observed ASVs、Shannon和Simpson），并使用Bray-Curtis距离评估Beta多样性。使用Kruskal-Wallis检验，然后进行Bonferroni事后检验，测试微生物类群相对丰度的组间差异。构建维恩图以显示不同样本组之间共有或独有的ASV数量。使用线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）识别差异丰度的微生物类群，以LDA得分（log10）> 2作为生物标志物检测阈值。进行随机森林分析以识别海拔组的判别性微生物特征，并通过递归特征消除评估和递归优化特征重要性。使用PICRUSt2（通过系统发育调查群落）预测微生物群落的功能潜力，并映射到京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析。
脑电信号记录 使用32通道Neuroscan系统配合eego软件，在电屏蔽室内对211名参与者中的135人进行脑电（EEG）数据采集。Ag/AgCl电极根据国际10-20系统放置，在线参考为双侧乳突（M1/M2），接地为GND，阻抗保持在5 kΩ以下。为减轻记录和分析负担，脑电信号以500 Hz采样。所有参与者在实验前24小时禁绝咖啡、酒精和精神活性药物，并保持规律作息。记录5分钟静息态脑电，期间参与者保持闭眼清醒状态并尽量减少动作以减少伪迹。随后进行视觉oddball任务，使用E-Prime 2.0呈现刺激和记录数据。随机数字在中央出现，标准刺激为“8”（80%概率），目标刺激为“2”（20%概率）。每个试次以800毫秒中央注视点“+”开始，然后是数字（50毫秒）和持续时间在1000至1200毫秒之间的随机空白屏。参与者仅对目标“2”按鼠标左键。每名参与者完成200个试次。
静息态脑电分析 原始脑电数据使用MATLAB 2021b中的EEGLAB进行预处理。连续记录依次进行滤波：1 Hz高通、40 Hz低通和48-52 Hz陷波滤波。目视检查所有数据段，排除包含明显伪迹的部分。独立成分分析（ICA）去除眨眼、眼动、肌肉活动和心脏干扰等伪迹成分。拒绝振幅超过±100 μV的数据段。最后，将数据重参考为全脑平均值，并为每名参与者分段为2秒长的数据段。
功率谱密度（PSD）使用Welch方法在1至30 Hz范围内估算，使用1秒滑动的汉宁窗，50%重叠，1 Hz频率分辨率。随后通过对数转换（10·log10）将平均PSD转换为分贝单位（dB/Hz）。感兴趣的频段分别定义为Delta（1-4 Hz）、Theta（4-7 Hz）和Alpha（7-13 Hz）。对于每个频段，评估额叶（F3, Fz, F4）、中央（C3, Cz, C4）、顶叶（P3, Pz, P4）和枕叶（O1, Oz, O2）电极区域的组间差异。
功能连接（FC）使用加权相位滞后指数（WPLI）进行评估，以量化脑电信号中神经振荡之间的相位同步强度。WPLI根据虚部幅度对交叉谱进行加权，范围从0（无同步）到1（完美同步）。对于每名参与者，通过在每个分析频率和时间点计算WPLI，得出30×30的连接矩阵。随后通过分别对Delta、Theta和Alpha频段内的WPLI取平均来提取代表性值。
任务态脑电分析 连续记录依次进行滤波：0.1 Hz高通、40 Hz低通和48-52 Hz陷波滤波。将数据相对于刺激 onset 分段为-600至1000毫秒的数据段，用于目标和标准刺激，并使用-600至0毫秒间隔进行基线校正。排除错误反应的试次后，目视检查所有数据段，去除包含明显伪迹的部分。独立成分分析（ICA）去除眨眼、眼动、肌肉活动和心脏干扰等伪迹成分。拒绝振幅超过±100 μV的数据段。最后，将数据重参考为平均的双侧乳突电极（M1和M2）。对于事件相关电位（ERP）分析，提取相对于刺激 onset 的-200至1000毫秒的数据段，并使用-200至0毫秒进行基线校正。对于时频分析，提取相对于刺激 onset 的-600至1000毫秒的数据段，并使用-400至-200毫秒进行基线校正。
基于先前研究和当前研究中观察到的波形特征，将特定成分的时间窗和电极位点定义如下：P3成分为320-480毫秒，N1成分为140-180毫秒。然后在顶叶电极（P3, Pz, P4）上对波幅取平均。对于每名参与者，通过分别对oddball和标准刺激的所有试次进行平均，得出事件相关电位（ERP）波形。随后为每个识别出的峰值计算成分潜伏期。
时频数据在1-30 Hz频率范围内分析，使用400毫秒汉宁窗、1 Hz频率步长和2毫秒时间步长计算功率变化。刺激后功率使用转换公式（10 × log10[功率(t)/功率(基线)]）转换为分贝（dB）标度。最后，对于每名参与者，选择感兴趣的时间窗为Delta和Theta频段350-500毫秒，Alpha频段150-250毫秒。然后在顶叶电极（P3, Pz, P4）上对功率值取平均。
统计分析 使用SPSS软件进行统计分析。评估所有数据集的正态性和方差齐性。使用Kruskal-Wallis检验分析人口统计学和神经心理学变量。使用卡方检验分析分类变量。使用单因素方差分析（ANOVA）检查跨额叶、中央、顶叶和枕叶区域的谱功率差异。使用2（条件：oddball vs 标准）× 3（海拔：2, 3, 4公里）方差分析（ANOVA）分析事件相关电位（ERP）和时频数据。使用斯皮尔曼相关分析评估脑电指标与微生物丰度之间的关联，并在回归模型中将焦虑、抑郁、睡眠质量和CVLT再认评分作为协变量。所有检验均为双尾，显著性水平设为α = 0.05。功能连接（FC）分析应用错误发现率（FDR）校正，其他事后多重比较使用Bonferroni校正。
结果
人口统计学和神经心理学信息 三组在年龄、性别和教育程度上未观察到显著差异。4公里海拔的原住人群报告了更高的焦虑评分（SAS；对比2公里：P= 0.008；对比3公里：P= 0.010）和抑郁评分（SDS；对比3公里：P= 0.003），以及更差的睡眠质量（PSQI；对比2公里：P= 0.012）。2公里组显示出比3公里组更高的CVLT再认数（P< 0.001）。从135份脑电记录中，5名参与者因过多伪迹从静息态分析中排除，14名因过多伪迹或任务表现差从任务态分析中排除。最终的脑电样本在年龄、性别和教育程度上在各组间是平衡的。总之，最高海拔的原住人群与更差的情緒、睡眠质量和语言记忆相关。
功率谱密度结果 在额叶、中央和枕叶电极簇中识别到Delta频段功率的显著组间差异。事后比较证实，与2公里组相比，4公里组在额叶、中央和枕叶簇的Delta功率显著更大。在Theta或Alpha频段未观察到显著差异。与2公里组相比，4公里组的Delta频段功能连接增强，特别是在额叶和枕叶区域之间。未观察到其他显著的组间差异。这些结果表明，高海拔暴露与静息大脑中低频振荡活动和功能连接的增强有关。
事件相关电位结果 对于N1成分，分析证实了显著的组主效应以及刺激与组之间的显著交互作用。事后检验表明，4公里组对oddball刺激的N1波幅高于2公里组和3公里组，而标准刺激无显著差异。对于P3成分，观察到显著的组主效应以及刺激与组之间统计学上显著的交互作用。4公里组表现出比2公里组和3公里组更大的P3波幅。相比之下，标准刺激未发现显著差异。峰值潜伏期在各组间无显著差异。总之，这些事件相关电位（ERP）改变表明高海拔影响了注意力处理的不同阶段，表现为对oddball刺激的N1和P3增强。
时频结果 在顶叶电极观察到显著的Delta频段活动。统计分析表明，组对Delta功率有显著主效应，以及刺激与组之间相当程度的交互作用。事后检验表明，在oddball刺激期间，4公里组表现出比2公里组更大的Delta功率。相比之下，标准刺激未出现显著的组间差异。Theta和Alpha频段活动均未显示显著性。这种模式表明高海拔与认知参与期间增加的Delta频率神经活动相关。
差异微生物组成 16S rRNA测序共获得15,421,758条高质量序列。稀释至均匀深度29,678条序列后，鉴定出200,143个扩增子序列变体（ASV）。在门和属水平的群落组成分析显示，厚壁菌门是优势门，其次是放线菌门、拟杆菌门和变形菌门。在属水平，双歧杆菌属、链球菌属和罗斯氏菌属是优势属。与2公里组相比，4公里组表现出显著更高的群落丰富度。Bray-Curtis距离证实肠道菌群组成在不同海拔组间存在显著差异。维恩图显示所有样本共有7,909个ASV，2、3、4公里组分别有77,439、51,688和59,591个独特的ASV。
属水平比较分析显示，4公里组罗斯氏菌、布劳特氏菌和粪球菌的丰度升高。值得注意的是，大多数差异菌属聚集在4公里组，主要是厚壁菌门成员。LEfSe分析识别出不同海拔间独特的微生物类群模式，其中1个细菌类群在2公里组富集，4个在3公里组富集，13个在4公里组富集。其中，布劳特氏菌、罗斯氏菌和吉米格菌在4公里组占主导地位。随机森林建模将乳球菌属、罗斯氏菌属和梭菌属识别为按特征重要性排名靠前的属。总之，高原原住人群与独特的肠道微生物特征相关，其特征是多样性增加和产短链脂肪酸（SCFA）菌属的富集。
功能预测 来自KEGG注释的预测功能谱揭示了跨海拔组微生物代谢潜力的差异。在通路水平，与2公里组相比，4公里组显示出与磷酸戊糖途径、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及安莎霉素生物合成相关的预测基因丰度显著更高。与这些功能上不同的组间丰度模式相关的微生物属。产短链脂肪酸（SCFA）的布劳特氏菌、粪球菌和罗斯氏菌的相对丰度在4公里组显著高于2公里组。此外，与3公里组相比，4公里组显示出更高的吉米格菌和拟杆菌丰度。预测的功能谱指向高原微生物组中能量和生物合成代谢的增强，这与产短链脂肪酸（SCFA）细菌的增加相关。
脑电指标与肠道菌群之间的关联 静息态Delta功率谱密度与特定微生物属呈正相关。Delta频段功能连接与布劳特氏菌、多尔氏菌、柯林斯氏菌和图里奇杆菌的丰度呈正相关。对于任务态指标，观察到吉米格菌丰度与N1波幅呈负相关。相比之下，任务相关的Delta功率与梭菌的丰度呈正相关。此外，功率谱密度与多个CVLT评分显著正相关。功能连接与焦虑评分、睡眠质量评分和CVLT评分呈正相关。结果表明特定肠道微生物类群与脑电模式之间存在相关性，这些模式进一步与焦虑和睡眠障碍相关。
讨论
高海拔静息态Delta增强与功能连接重组 大脑高度依赖氧气，其正常功能依赖于持续稳定的血液供应。在急性高海拔暴露期间，脑血流量重新分配，优先支持与感知、认知控制和问题解决等核心认知功能相关的脑区，同时相对减少对其他认知能力的支持。这些脑血流动力学的适应性变化可能进一步影响神经电活动模式。本研究观察到随着海拔升高，大部分脑区的Delta功率升高。Delta振荡在神经整合和维持稳态中起关键作用，特别是在注意调节、显著性检测和阈下感知中。因此，Delta升高可能代表了一种在缺氧条件下保存基本脑功能的代偿机制。值得注意的是，额叶皮层参与认知和情绪调节。长期高海拔暴露可导致注意力和抑制控制损伤，这可能与前额叶功能障碍有关。本研究中观察到前额叶和枕叶区域之间功能连接增强。这可能反映了一种代偿性重组，以促进高海拔下感知和执行过程的整合。此外，在急性高海拔暴露期间，Alpha频段活动显著减少的报道。Alpha活动减少反映了中枢神经系统内功能连接的减弱，可能导致认知缺陷。然而，随着个体对高海拔条件的习服，Alpha活动可能恢复正常甚至增加。本研究中Alpha振荡无显著组间差异，也可能支持长期适应使该频段正常化的观点。总之，Delta功率的增加以及枕叶和额叶区域连接性的增强，可能说明了高原原住人群的一种适应模式。
高海拔认知任务中P3和Delta功率增强 在事件相关电位（ERP）分析中，4公里组在顶叶区域表现出明显更大的P3波幅。P3成分主要在执行控制任务期间引发，在冲突条件下通常增强，反映了注意资源分配、工作记忆和信息处理等认知过程。由于P3波幅被认为反映了资源分配的效率，这表明高原居民可能调动更多的注意资源来解决目标-干扰物冲突。有趣的是，N1成分在4公里组显著更低。N1成分是刺激开始后出现的早期负波，反映了初始的感觉处理。N1波幅降低可能表明早期感知阶段资源投入减少。因此推测，4公里居民相对降低的N1波幅反映了早期感知处理效率的提高。这种增强的效率可能反过来支持后期需要更多资源投入的P3相关认知操作。与静息态Delta增强一致，在oddball任务期间，4公里组发现顶叶Delta功率升高。Delta活动与目标检测密切相关，其在任务参与期间的增加表明处理目标刺激的效率提高。这也可能支持高原人群的适应。
高海拔响应的肠道菌群重组 最近的研究强调了肠道菌群在宿主适应高海拔环境中的重要性。迁移到高海拔后，肠道菌群逐渐转向类似于原住人群的组成。此外，一些这些与海拔相关的微生物特征即使在返回低地条件后仍可持续。与这种适应可塑性一致，本研究发现不同海拔组肠道菌群结构存在差异。观察到几个厚壁菌门成员对海拔敏感，其中罗斯氏菌、布劳特氏菌和粪球菌在4公里处显著富集。这与一项将罗斯氏菌、粪杆菌、多尔氏菌和粪球菌识别为高海拔常见微生物生物标志物的荟萃分析结果一致。这有助于解释厚壁菌门在高海拔的优势地位，并表明它们在这些条件下对宿主适应具有重要作用。
高海拔肠道菌群组成与改变的脑电活动相关 相关性分析进一步揭示，布劳特氏菌和多尔氏菌的相对丰度与Delta频段功能连接正相关。布劳特氏菌和多尔氏菌有助于短链脂肪酸（SCFA）的产生。布劳特氏菌通过短链脂肪酸介导免疫调节，如在帕金森病中减轻神经炎症所证明的。此外，短链脂肪酸也有助于神经调节。它们在下丘脑中积累，刺激抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的合成。GABA是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，并与乙酰胆碱协同作用。这可能加强了丘脑皮层系统内关键抑制网络的功能，从而促进了Delta频段跨脑区相位同步的增强。这些发现共同表明，肠道菌群和大脑功能相互关联，并可能支持肠-脑相互作用在高海拔适应中的作用。
进一步发现，布劳特氏菌还可能通过肠-脑
