肺炎克雷伯菌中Lon蛋白酶介导的分泌组分析

《Microbiology Resource Announcements》：Lon protease-mediated secretome profiling in Klebsiella pneumoniae

Lon蛋白酶通过调控外膜蛋白组装和铁稳态影响细菌分泌蛋白的动态变化。采用底向上蛋白质组学分析发现Δlon菌株在铁限制和铁富集条件下分别有15种和9种外泌蛋白，其中HupB、RplK、OmpA等蛋白的丰度差异显著，提示Lon缺失影响细菌应激响应和膜结构完整性。

　　

摘要

Lon蛋白酶是细菌中的全局调节因子，影响生物膜的形成、抗生素抗性、毒素-抗毒素复合物以及受损蛋白质的蛋白水解。在Klebsiella pneumoniae中，Lon参与铁响应、蛋白质运输和膜组装。在本研究中，我们采用自下而上的蛋白质组学方法来鉴定野生型（WT）和Δlon K. pneumoniae细胞外环境中的蛋白质。

公告

在细菌中，Lon蛋白酶是一种胞质酶，通过蛋白水解参与关键细胞功能，如铁稳态（1）、DNA复制（2–4）、毒力（1–7）、荚膜产生（8–10）和应激反应。我们之前关于Klebsiella pneumoniae中lon缺失对细胞蛋白质组影响的研究揭示了该蛋白酶的已知和新的靶标，包括与运输（例如PgaA）和外膜组装（例如BamA）相关的蛋白质（1）。在本研究中，我们比较了Δlon与野生型（WT）K. pneumoniae的分泌组，以探讨lon缺失对细菌运输和分泌调控的下游影响。

实验中，将K. pneumoniae WT K52血清型（ATCC 700721）和Δlon接种在6 mL Luria-Bertani（LB）培养基中，37°C下摇床培养过夜。随后收集1 mL培养液，3500 × g离心10分钟，用1 mL M9最小培养基（MM；含Chelex 100处理的[Bio-Rad] MilliQ水，玻璃器皿用3 M HCl、6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl和0.4% [w/v]葡萄糖以及2 mM MgSO₄和0.1 mM CaCl₂洗涤两次（1）。细胞重新悬浮在1 mL MM中，并继代培养到5 mL LB（即富铁条件）、MM（即缺铁条件）或添加了10 μM Fe₂(SO₄)₃的MM（即铁充足条件）中。细胞在37°C下摇床培养，收集对数生长期后期（LB培养的菌株约14小时，MM培养的菌株约6小时）的上清液。

样品按照先前的方法制备用于质谱分析（111–14），每种菌株和培养条件重复五次。具体步骤为：用0.22 μm孔径过滤器过滤1.2 mL上清液；加入333 μL 8 M尿素/40 mM HEPES；在95°C下用二硫苏糖醇（最终浓度10 mM）处理10分钟；然后用碘乙酰胺（最终浓度55 mM）烷基化20分钟（室温，避光）。样品在室温下用4 μL胰蛋白酶/LysC蛋白酶消化过夜（Promega）。肽段通过STop And Go（STAGE）吸头干燥和纯化（15），并重新溶解在40 μL 0.1%甲酸中。根据制造商的说明，将每个样品1.5 μg（根据Thermo NanoDrop One在280 nm波长下的测量结果）加载到Evotips上（16），并在Evosep One液相色谱系统上使用15 cm PepSep柱（直径150 μm，珠子直径1.9 μM）进行88分钟的分析，该系统连接Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240质谱仪。质谱分析采用数据依赖的正离子模式，前体质量范围400–2,000 m/z，分辨率60,000，强度阈值2.5e4。.RAW文件使用MaxQuant v2.4.0.0处理（17），除非另有说明，否则使用默认参数。肽段通过K. pneumoniae subsp. pneumoniae K52血清型（来自UP000000265蛋白质组的5,126个序列；访问日期2022年12月2日）（18）进行比对。比对参数包括：胰蛋白酶特异性（最多允许两次切割错误）、半胱氨酸的氨基甲酰化（固定）、甲硫氨酸的氧化和N-乙酰化（可变）。蛋白质鉴定的肽段数量为两个，蛋白质丰度通过无标签定量（LFQ）确定，比率计数设置为1（19）。运行间的匹配通过0.7分钟的匹配窗口和20分钟的对齐窗口实现（19）。

在Perseus v2.0.7.0中（20），去除了由位点修饰的污染物和反向肽段，并对每种培养条件下的三个重复样本进行了有效值过滤。LFQ强度进行了log₂转换，缺失值通过正态分布进行插补（即从平均值向下移动1.8个标准差，选择在?1.95至?1.65标准差范围内的值）。蛋白质丰度的显著差异通过Student’s t-检验确定，置信区间为95%，Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）截止值为5%，S₀ = 1。可视化使用ProteoPlotter完成（21）。

我们鉴定出Δlon分泌的15种蛋白质和WT分泌的9种蛋白质（在所有三种培养条件下）（表1）；其中6种蛋白质仅存在于Δlon的分泌组中（图1a）。值得注意的是，分泌组中检测到了核糖体蛋白，这表明可能存在细胞裂解或检测到了与细胞外囊泡相关的蛋白质（22）。在LIM条件下，Δlon分泌组中有两种蛋白质的丰度高于WT（即RpsT、RplK；图1b）；在铁充足条件下，Δlon中有五种蛋白质的丰度高于WT（即HupB、RplI、RplA、GapA和HupA；图1c），而在铁充足条件下，有三种蛋白质的丰度高于Δlon（即RplK、RpsT和MltD；图1c）。

表1

表1 在LB、铁充足或最小培养条件下，Δlon和WT分泌组中鉴定出的蛋白质及其根据UniProt注释的功能（23

铁充足
和
LIM铁充足
和
LIM铁充足
和
LIM含有YdgH/BhsA/McbA结构域的蛋白质铁充足
和
LIM铁充足
和
LIMLB超氧化物歧化酶 [Cu-Zn]LBEcotinLIM磷酸甘油酸激酶铁充足
和
LIM小核糖体亚基蛋白uS5铁充足
和
LIM50S核糖体蛋白L11铁充足
和
LIM50S核糖体蛋白L1hupA铁充足
和
LIMDNA结合蛋白HU-alpharplI铁充足
和
LIM50S核糖体蛋白L9

UniProt访问号	基因名称	培养条件	菌株	蛋白质功能
A6T4F8	rpsT	Δlon & WT	30S核糖体蛋白S20
A6T509	mltD	Δlon & WT	肽聚糖裂解外转糖基酶
A6T5I3	hupB	Δlon & WT	DNA结合蛋白HU-beta, NS1 (HU-1)
A6T5S6	KPN_00497	LB	Δlon
A6T751	ompA	Δlon & WT	外膜蛋白A
A6T7Q9	gapA	Δlon & WT	甘油醛-3-磷酸脱氢酶
A6T970	KPN_01710	铁充足 和 LIM	Δlon & WT	甘油醛-3-磷酸脱氢酶
A6T9Z5	sodC	Δlon
A6TBS4	eco	Δlon
A6TDT1	pgk	Δlon
A6TEV5	rpsE	Δlon & WT
A6TGN5	rplK	Δlon & WT
A6TGN6	rplA	Δlon & WT
A6TGQ7	Δlon
A6THB4	Δlon

图1

图1 WT和Δlon分泌组的分析结果。（a）Venn图显示WT和Δlon分泌组中鉴定的蛋白质。（b）火山图显示在LIM条件下Δlon分泌组中比WT分泌组更丰富的蛋白质。（c）火山图显示在铁充足条件下Δlon分泌组中比WT分泌组更丰富的蛋白质。火山图的统计分析采用Student’s t-检验，P-值 < 0.05；FDR = 0.05；S₀ = 1。

致谢

作者感谢Rapid Novor提供质谱仪，并感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC—Discovery Grant）对J.G.-M.的资助。