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本研究通过对耐盐植物酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）进行全基因组分析，首次系统鉴定了其Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）基因家族，并对8个成员的系统进化、基因结构、启动子顺式作用元件及在盐、旱胁迫下的表达模式进行了深入解析。结果表明，ZjNHX基因在维持细胞离子稳态和酸枣的盐胁迫适应中扮演关键角色，为后续利用该基因家族进行枣树耐盐遗传改良提供了重要的候选基因资源和理论基础。
引言：盐胁迫与耐盐植物酸枣
土壤盐渍化是限制全球农业可持续发展的主要非生物胁迫因子之一。酸枣（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa）作为一种重要的经济果树，对盐碱、贫瘠和干旱等逆境表现出显著的耐受性，是研究植物耐盐机制的理想材料。植物进化出一系列复杂的生理和分子机制以应对盐胁迫，其中，Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）通过介导Na+/H+交换，在维持细胞内离子稳态和pH平衡方面起着核心作用。尽管NHX基因家族已在多种植物中得到鉴定，但其在酸枣中的系统研究尚属空白。本研究旨在对酸枣NHX基因家族进行全基因组鉴定与表征，以阐明其在盐胁迫适应中的潜在功能。
材料与方法
研究基于已公布的酸枣基因组数据，以拟南芥（Arabidopsis thaliana）的8个NHX蛋白序列为查询序列，通过BLASTP和隐马尔可夫模型（HMM）搜索，结合保守结构域验证，在全基因组范围内鉴定酸枣NHX基因家族成员。对鉴定出的基因，进行了染色体定位、蛋白质理化性质、系统进化树构建、保守基序与基因结构、共线性与选择压力、启动子顺式作用元件等生物信息学分析。此外，利用公开的转录组数据（SRP344288， SRP321496）分析了ZjNHX基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，并通过qRT-PCR实验进一步验证了关键基因在150 mM NaCl处理不同时间点（0， 3， 6， 12， 24 h）的根和叶中的表达变化。
结果
3.1. ZjNHX基因家族的鉴定与理化性质分析
在酸枣基因组中共鉴定到8个NHX基因家族成员，根据其线性染色体位置，将其命名为ZjNHX1至ZjNHX8。这些基因分布在6条染色体上，呈现非均匀分布。蛋白质理化性质分析显示，ZjNHX蛋白长度介于207至1145个氨基酸之间，分子量在22.47至126.83 kDa之间，理论等电点（pI）在5.35到8.75之间变化。所有蛋白的GRAVY值均为正，表明其具有疏水性。亚细胞定位预测显示，ZjNHX1–ZjNHX5和ZjNHX8可能定位于液泡，而ZjNHX6和ZjNHX7则可能位于质膜。跨膜螺旋预测证实大多数蛋白含有9-12个跨膜结构域。
3.2. 系统进化分析
基于酸枣与其他9个物种（包括拟南芥、水稻、葡萄、番茄等）共99个NHX蛋白序列构建了系统进化树。所有NHX蛋白被聚为三个进化枝，与拟南芥AtNHX蛋白的分类一致，分别命名为液泡型（Vac）、内体型（Endo）和质膜型（PM）。在酸枣中，ZjNHX6和ZjNHX7属于PM枝，ZjNHX2属于Endo枝，其余五个ZjNHX蛋白（ZjNHX1， ZjNHX3， ZjNHX4， ZjNHX5， ZjNHX8）则分布在Vac枝。
3.3. 外显子-内含子分析与基序组成
系统进化、保守基序和基因结构的综合分析表明，同一进化枝内的成员具有相似的结构特征。保守基序分析显示，基序1、2、3对应于Na+/H+交换器结构域内的保守区域。值得注意的是，基序3包含了阿米洛利结合位点（FF(I/L)(Y/F)LFLLPPI），这是液泡型NHX蛋白的特征，该位点存在于Vac枝和Endo枝（ZjNHX2）的成员中，但在PM枝中缺失。多序列比对进一步证实了这一结果，其中ZjNHX3在该位点存在一个氨基酸替换（I→M）。基因结构分析显示，Vac枝成员大多含有12-14个外显子，Endo枝的ZjNHX2含有22个外显子，而PM枝的ZjNHX6和ZjNHX7则含有23个外显子，结构最为复杂。
3.4. 复制事件、共线性与选择压力分析
基因复制事件分析表明，酸枣NHX基因家族的进化由不同类型的基因复制驱动。共线性分析在酸枣基因组内鉴定到两个共线性基因对：ZjNHX5-ZjNHX3和ZjNHX5-ZjNHX8。计算其非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）的比值（Ka/Ks），所有基因对的Ka/Ks值均显著小于1，表明该基因家族在进化过程中受到了强烈的纯化选择。分歧时间估算显示，这些同源基因对分别在大约55.411百万年前和59.228百万年前形成。种间共线性分析显示，酸枣与拟南芥之间存在5个共线性基因对，与水稻之间存在4个。
3.5. ZjNHX基因启动子顺式作用元件分析
对每个ZjNHX基因起始密码子ATG上游2000 bp的启动子序列进行分析，共鉴定出52种类型的顺式作用调控元件，可分为光响应、胁迫响应、植物激素响应和生长发育调控四类。其中，光响应元件最为丰富。胁迫响应元件中，MYB和MYC结合位点广泛存在，这与ABA依赖和非依赖的胁迫信号通路有关。此外，启动子区域还富含对乙烯、茉莉酸甲酯、水杨酸和生长素等激素响应的元件，表明ZjNHX基因可能广泛参与多种激素信号通路。
3.6. 基于转录组数据的ZjNHX在干旱和盐胁迫下的表达分析
利用转录组数据分析ZjNHX基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达谱。在盐胁迫下，ZjNHX2， ZjNHX3， ZjNHX5和ZjNHX6在根和叶中均被上调表达，且200 mM NaCl处理下的表达水平高于100 mM。在干旱胁迫下，ZjNHX2， ZjNHX3， ZjNHX5， ZjNHX6和ZjNHX7在二倍体和同源四倍体酸枣的叶片中均表现上调。这些差异表达模式表明ZjNHX基因在非生物胁迫响应中具有功能分化。
3.7. 盐胁迫下ZjNHX基因的表达分析
通过qRT-PCR进一步分析了ZjNHX基因在150 mM NaCl处理24小时内根和叶中的表达动态。结果显示，大多数ZjNHX基因在盐胁迫下表达上调，且表现出显著的时空特异性。在根中，ZjNHX1， ZjNHX6和ZjNHX7的表达在盐处理3小时内迅速上调。其中，ZjNHX1的表达变化最为显著，在盐胁迫3小时内其表达量相比对照组增加了约40倍，并在24小时时仍维持在高水平。在叶中，ZjNHX2和ZjNHX3的表达随着盐胁迫时间的延长呈逐渐增加的趋势，这与转录组数据一致。而ZjNHX1在叶片中的表达则呈现先下降后上升的模式。
讨论
NHX基因家族通过Na+/H+逆向转运活性维持细胞离子稳态，在调节细胞内pH、维持Na+/K+平衡以及增强植物耐盐性方面起着关键作用。本研究在酸枣中鉴定到8个NHX基因，其数量与拟南芥一致。系统进化分析将其分为三个进化枝，其中液泡型（Vac）成员最多，这与在许多植物中的发现一致。然而，亚细胞定位预测与系统进化分类存在不一致的情况，例如聚类于内体型（Endo）的ZjNHX2被预测定位于液泡，这反映了当前预测算法对复杂膜蛋白的局限性，其精确定位需要进一步的实验验证。
基因结构和基序组成在同一个进化枝内高度保守。所有ZjNHX蛋白均预测含有9-12个跨膜结构域。阿米洛利结合位点存在于所有Vac枝成员以及Endo枝的ZjNHX2中，但在PM枝中缺失。值得注意的是，Vac枝的ZjNHX3在该位点存在一个氨基酸替换（I→M），这种保守性替换可能不影响核心转运功能，但其对抑制剂敏感性或离子选择性的潜在影响有待实验研究。
表达分析表明，ZjNHX基因对盐胁迫的响应具有组织特异性和时间依赖性。在根中，ZjNHX1的快速且强烈诱导暗示其可能在盐胁迫早期参与根部的液泡Na+区隔化，以限制Na+向地上部的转运。在叶中，ZjNHX2和ZjNHX3的持续上调则可能与叶片长期的离子平衡和渗透调节有关。这些差异化的表达模式提示不同的ZjNHX成员在盐胁迫响应中可能扮演着不同的角色，共同构成了酸枣应对盐胁迫的复杂调控网络。
结论
本研究首次在酸枣中完成了NHX基因家族的全基因组鉴定与综合分析。共鉴定出8个ZjNHX基因，根据系统进化、保守基序和基因结构将其分为三个亚家族。启动子分析揭示了丰富的胁迫和激素响应顺式作用元件。表达谱分析表明，多个ZjNHX成员在盐胁迫下以组织特异性和时间依赖性的方式被差异调控，其中ZjNHX1， ZjNHX2和ZjNHX3是后续功能研究的强有力候选基因。这些研究成果为深入理解酸枣的耐盐分子机制提供了重要的基因组资源，也为利用NHX基因进行枣树耐盐遗传改良奠定了理论基础。
